[发明专利]一种用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊的方法

权利要求书

1.一种用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因羊受精卵的方法，其特征在于： 将慢病毒载体与病毒包装质粒共转染为293T细胞，至48小时后离心，得慢病 毒的浓缩液，将其注射于成熟24-25小时的卵母细胞卵周隙内，与精子结合实 施体外受精，12小时后置于培养液中培养，48小时后统计卵裂率和转基因率；

其一，取绵羊卵巢，用生理盐水灭菌清洗3-4次，抽取卵母细胞，用体外 成熟液洗涤3-4次，按25-30枚/滴入前2小时平衡好的体积为75-78μl/滴的 体外成熟培养液滴，放入CO₂箱，在5％CO₂，95％空气条件下培养；

其二，将体外成熟24-25小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理 30-60s，经吹吸，脱去卵丘细胞；将慢病毒注射入卵母细胞卵周隙内，用体外受 精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入前2小时平衡好的50-70μl的受 精液内；用水浴解冻精液，移入2小时前平衡好的装有受精液的试管内，放入C0₂箱，上游20-25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清 液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2-4×10⁶个/ml的密度加入受精液滴， 与处理好的卵母细胞共同孵育；

其三，将受精12-18小时后的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤 3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养；

药剂的配制：

抽卵液：TCM199-hepes十1mg/mlPVA十0.7mg/ml肝素钠；

成熟液：TCM199-HCO₃十10％FBS十0.05IU/ml FSH十0.05IU/ml LH十1μ g/ml雌二醇+24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml 双抗；

显微操作液：PBS+10％FBS；

SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH₂PO₄+0.6ul/ml乳 酸钠+0.089mg/mlMgSO₄+2.1mg/mlNaHCO₃+0.0357mg/ml丙酮酸钠 +0.299mg/mlCaCL₂·2H₂O；

受精液：SOF+20％发情羊血清+6IU/ml肝素钠+100IU/ml庆大霉素；其采羊 的静脉血，放置4℃冰箱内冷冻24小时，将析出的血清放在56℃水浴锅内灭活 30-33分钟，即得发情羊血清；

培养液：SOF+3mg/ml BSA。

2.按照权利要求1所述生产转基因羊受精卵的方法，其特征在于：慢病毒 在转染293T细胞时，采用细胞仪检测，滴度达到1.5×10⁹tu/ml。

3.按照权利要求1所述生产转基因羊受精卵的方法，其特征在于：在抽取 卵母细胞前，先吸入1毫升吸卵液备用。

4.按照权利要求1所述生产转基因羊受精卵的方法，其特征在于：选用配 制药品的原料，除自制外，均为市售产品。