[发明专利]一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及卵母细胞体外筛选技术，采用亮甲酚蓝(BCB)染色液对绵羊卵母细胞进行染色筛选，可提高卵母细胞体外受精率及胚胎体外发育率。 

背景技术

卵母细胞体外筛选，通常采用直观评定法，即根据显微镜下观察的卵丘细胞一卵母细胞复合体形态和细胞质均匀度进行分类。A级：三层以上致密卵丘细胞，细胞质均匀；B级：一至三层较致密卵丘细胞，细胞质较均匀；C级：局部有卵丘细胞，细胞质不均匀；D级：裸卵；E级：卵丘细胞扩散。通常将A、B级用于成熟培养，但这种方法主观性强，不同人员判断问有差异，培养后的成熟率也不一致。文献检索披露：1.Theriogenology，68(2007)1299-1304作者：B.M.Manjunatha等，发表的《成熟前用亮甲酚蓝选择有发育潜力的水牛卵母细胞》文章内容是，将卵母细胞置于BCB染色液90分钟，比较了不同浓度BCB对卵母细胞的选择率；比较了经过选择的阴阳性卵母细胞直径的差别；比较了不同实验组(对照组，空白组，阳性组，阴性组)成熟率，囊胚率，结果阳性组高于其他组。2.Theriogenology，63(2005)2194-2205，作者：H.Alm等发表的《成熟前用可以检测G6PDH活性的亮甲酚蓝选择卵母细胞对牛体外囊胚发育率的影响》文章内容是，检测了经过BCB染色的阴、阳性卵母细胞在G6PDH活性上的差别，阴性组G6PDH活性高于阳性组和实验组。但阳性组体外成熟率、囊胚率高于其他组。3.Theriogenology，57(2002)1397-1409，作者：E.Rodriguez-Gonzalez等发表的《用亮甲酚蓝选择羔山羊卵母细胞》文章内容是，研究了不同浓度BCB染色液对羔山羊卵母细胞的选择，比较经过选择后的卵母细胞的体外受精率和成熟率，发现26μM浓度的染色液适合羔山羊卵母细胞的选择。经过选择后的阳性卵母细胞在细胞直径，体外发育率等方面都显著高于阴性卵母细胞。4.Theriogenology，61(2004)735-744，作者：MarcPujol等发表的《通过亮甲酚蓝(BCB)选择具有发育潜力的小母牛卵母细胞》文章内容是，研究了BCB染色液在用于体外胚胎生产的小母牛卵母细胞上的选择作用。比较了阳性卵母细胞与对照组以及成年母牛之间发育潜力、卵母细胞直径差异，结果表明：不同等级卵母细胞选择率不同，阳性卵母细胞直径大于阴性卵母细胞，阳性胚胎囊胚发育率高于阴性组和对照组，但低于成年母牛组。国内有关中国农业科学院北京畜牧兽医研究所乔利敏等8人发表的《亮甲酚蓝染色对牛卵母细胞体外成熟及体外受精的影响》也将亮甲酚蓝染色液用于牛卵母细胞的筛选等。上述已有技术很少见到，亮甲酚蓝染色液在绵羊卵母细胞上的应用，本发明以此为切入点，展开的方法学与应用学的研究，更具有实践意义。

发明内容

本发明的目的在于：提供绵羊卵母细胞体外筛选培养的方法，即采用亮甲酚蓝(BCB)染色液筛选方法，目的是提高体外受精率及胚胎发育率。 

本发明目的是这样实现的：一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法，分为亮甲酚蓝染色筛选及培养的步骤； 

其一，摘取宰杀后半小时内的绵羊卵巢，置入温度30-40℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用其清洗3-4次，在显微镜下捡出卵母细胞；添加浓度为25-30μMol/L的亮甲酚蓝染色液，置于35-39℃水浴中染色85-92分钟，待细胞质呈蓝色时，用体外成熟液洗涤3-4遍，按25-30枚/滴，放入前2小时平衡好的体积为55-78μl/滴的体外成熟液中，放入CO₂箱，在5％CO₂、95％的空气条件下培养； 

其二，将体外成熟25-28小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸，脱去部分卵丘细胞；用体外受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/滴的密度加入前2小时平衡好的50-70μl的体外受精液滴内；水浴解冻精液，移入前2小时平衡好的装有体外受精液的试管，放入CO₂箱，上游20-25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液；将剩余的精子沉淀，按2-4×10⁶个/ml的密度加入体外受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育； 

其三，将受精12-18小时的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4遍，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养，即完成体外受精筛选及培养。