[发明专利]水牛胚胎干细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明属动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域的水牛胚胎干细胞的制备方法。

背景技术

胚胎干细胞是20世纪后期生物技术领域的一项划时代的重大突破，它具有多能性和无限分裂增殖的特性，并可分化形成动物个体的各种终端细胞和胚胎嵌合能力，因而被广泛应用于动物遗传操作、细胞治疗和组织器官工程。虽然胚胎干细胞已先后在牛，小鼠，大鼠，猪，山羊，绵羊和兔等多种动物取得成功，但由于水牛的胚胎数量少、活力低，体外培养的难度较大，故水牛胚胎干细胞的分离培养至今尚未取得成功。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水牛胚胎干细胞的制备方法。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：

水牛胚胎干细胞的制备步骤为：

1.水牛囊胚内细胞团的分离：经体外受精获得的水牛囊胚和孵化囊胚，用针头去掉透明带并剥离滋养层细胞，获得内细胞团细胞，然后置于四孔培养板中进行培养。

2.囊胚内细胞团细胞的培养：分离得到的内细胞团置于含经丝裂霉素预处理的水牛胎儿成纤维细胞层作为饲养层细胞，用杜贝柯氏最低成分培养液(DMEM)+20％胎牛血清+0.1mM非必需氨基酸+0.1mM β—巯基乙醇+1mM丙酮酸钠+20ng/ml小鼠重组白血病抑制因子(mrLIF)+40ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和20ng/ml小鼠重组干细胞因子的培养液培养8～10天，获得原代水牛胚胎干细胞克隆。

3.胚胎干细胞的传代培养：获得的水牛胚胎干细胞克隆，用0.25％胰蛋白酶的溶液消化5min，或用针头直接机械分离后，接种于水牛胎儿成纤维细胞饲养层上，加入上述培养液继续培养。培养液每两天更换1次，直至形成干细胞克隆，再进行消化传代。

用本发明的方法获得的水牛胚胎干细胞，具有碱性磷酸酶(AP)，SSEA-1，SSEA-3和SSEA-4阳性染色，以及表达Oct-4(在动物早期胚胎发育过程中起重要作用的转录因子)，Nanog(胚胎干细胞自我更新所必需的基因)和Sox2人重组碱性成纤维细胞生长因子人重组碱性成纤维细胞生长因子(在早期胚胎发生、神经分化和晶状体发育等多种重要的发育事件中都起着关键的作用)基因等干细胞生物学特性，并通过体外分化实验证明这些细胞具有多能性，为利用水牛胚胎干细胞来进行水牛的定向遗传改良迈出了重要的一步。

附图说明

图1.利用机械分离法获得的水牛囊胚内细胞团细胞(A)和培养获得的水牛胚胎干细胞克隆(B)。

图2.获得的水牛胚胎干细胞呈现碱性磷酸酶染色阳性(A)，Oct-4(B)，SSEA-1(C)，SSEA-3(D)和SSEA-4(E)免疫荧光染色阳性水牛克隆。

图3.获得的水牛胚胎干细胞在无白血病抑制因子(LIF)的培养液中培养2周后，分化形成的上皮细胞(A)，成纤维细胞(B)，类神经元细胞(D)，以及悬浮培养形成的简单拟胚体(E)和囊状拟胚体。

具体实施方式

从屠宰场收集水牛卵巢，在实验室用注射器回收卵母细胞，然后进行体外成熟和体外受精。受精卵培养6～8天后，挑选获得的囊胚和孵化囊胚，用针头去掉透明带和滋养层细胞，得到内细胞团细胞。内细胞团置于含经丝裂霉素预处理的水牛胎儿成纤维细胞层的四孔培养板中，用杜贝科斯最低成分培养液DMEM+20％胎牛血清+0.1mM非必需氨基酸+0.1mM β—巯基乙醇+1mM丙酮酸钠+10～30ng/ml鼠重组白血病抑制因子mrLIF+40ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子bFGF和20ng/ml小鼠重组干细胞因子的培养液培养8～10天，获得原代水牛胚胎干细胞克隆。然后，将获得的水牛胚胎干细胞克隆，用0.25％胰蛋白酶的溶液消化5min，或用针头直接机械分离后，接种于新的水牛胎儿成纤维细胞饲养层上，加入上述培养液继续培养。培养液每两天更换1次，直至形成干细胞克隆，再进行消化传代。

对获得的水牛胚胎干细胞克隆，通过碱性磷酸酶染色初步鉴定其干细胞特性，并用SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4和OCT-4的单克隆抗体进行免疫荧光染色进一步鉴定其干细胞生物学特征。同时，通过无LIF培养液培养2周，检测其分化潜能；通过悬浮培养，观测其简单拟胚体和囊状拟胚体的形成能力。

实施例1