[发明专利]检测结核杆菌耐药基因膜芯片

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因膜芯片及其检测方法，特别是一种检测结核杆菌耐多药的基因型膜芯片。可适用于体外检测痰样、临床分离株以及组织样本中结核杆菌耐多药基因。 

背景技术

目前，对结核分枝杆菌耐药分子机制的研究主要集中于各种抗结核药物的作用靶位及其相关基因的突变。现在已经发现的结核杆菌基因突变的类型主要是点突变，其实质是一个基因内部的一个或几个核苷酸的插人、缺失或取代，致使错误的核苷酸密码翻译出错误的氨基酸顺序，导致结核杆菌对抗结核药物产生耐受。现已确定耐药的抗结核药物主要是异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、吡嗪酰胺、喹诺酮类等，并已证明结核分枝杆菌的耐药性分别与katG、inhA、ahpC、rpoB、embABC、rpsL、rrs、pncA、gyrAB等基因突变有关。在现阶段，我国各医院广泛采用痰培养加药物敏感性试验来检测结核杆菌的耐药性，即先培养出结核杆菌，再给予抗结核药物，并观察药物抑菌效果。该法的检测结果可靠，但最大不足之处是培养条件要求高，结核杆菌生长缓慢，往往需要6～8周；同时痰培养检出率低，仅为30％左右，故药敏试验的检出率也仅有30％左右，不能满足临床检测的需求。 

发明内容

本发明目的在于提供一种检测结核杆菌耐药基因膜芯片，它能够一次性检测引起结核杆菌对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、喹诺酮类药物耐药的常见的基因突变，是一种灵敏、特异、高效和实用的结核杆菌耐多药基因检测的方法。 

本发明解决上述技术问题的技术方案是：提供一种检测结核杆菌耐药基因膜芯片，所述膜芯片针对常见结核杆菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因的突变位点，设计54个检测探针，将探针点样于尼龙膜上构建成膜芯片，每一个被检测样本的DNA分4个反应管，每管加入三对不同的引物，共12对引物是分别针对结核杆菌rpoB、katG、embB、inhA、ahpC、gyrA、rrs、rpsL、pncA基因特异设计的，其中每对引物中的下游引物5’端均带有生物素标记，在同一PCR条件下4个反应管同时经三重PCR，扩增出大 量带有生物素的结核杆菌相应的基因片段产物，将扩增产物与膜芯片上的探针进行特异性杂交，杂交后带有生物素的目标基因与探针牢牢的结合在一块，洗去未结合的扩增基因片段，再进行酶联和显色反应即可用肉眼判断结果。 

所述54个检测探针中52个为结核杆菌检测探针，2个为质控探针。 

所述52个结核杆菌检测探针中，包括14个检测结核杆菌耐异烟肼的探针，分别命名为kaN1、kaN2、ka315M、inN1、inN2、inN3、inN4、inN5、inN6、in-15M、in94M、ahN1、ahN2、ah-15M，其探针序列(5’→3’)分别为： 

TTTTTTTTTAAGACCCATGGCGCCGGC 

TTTTTTTTTTGCGATCACCAGCGGCATC 

TTTTTTTTTTGCGATCACCAMCGGCATC 

TTTTTTTTTTCGCGGCGAGACGATAGGT 

TTTTTTTTATCATCACCGACTCGTCGATC 

TTTTTTTTTGATTCAGCGCATCACCGACC 

TTTTTTTTTGGTGCTCACCGGGTTCGAC 

TTTTTTTTGTGGTGCATTCGATTGGGTTC 

TTTTTTTTGGATGGGCATCAACCCGTTCT 

TTTTTTTTTTCGCGGCGAGATGATAGGT 

TTTTTTTTGTGGTGCATGCGATTGGGTTC 

TTGGTGTGATATATCACCTTTGCCTGACAG 

TTTTTTTTACTTCACGGCACGATGGAATGT 

TTTTTTTTACTTCATGGCACGATGGAATGT 

所述52个结核杆菌检测探针中，包括11个检测结核杆菌耐利福平的探针，分别命名为rpN1、rpN2、rpN3、rpN4、rpN5、rpN6、rp516M、rp526M1、rp526M2、rp531M1、rp531M2，其探针序列(5’→3’)分别为： 

TTTTTTTTGCCGCGATCAAGGAGTTCTTC