[发明专利]转基因水果的多重PCR反应的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因水果安全与检测技术领域，具体涉及了一种转基因水果的多重PCR检测方法；本发明还涉及了检测转基因水果的试剂盒。

背景技术

通过基因工程技术将外源基因导入至其他特定生物体中，使其产生正向遗传突变，改造了生物的遗传物质，使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变，成为一种具有全新特性的新型生物体。该生物体称为转基因生物体或基因修饰生物体(Genetically Modified Organisms，GMOs)，包括转基因动物、植物和微生物。转基因生物直接食用，或者作为加工原料生产的食品，统称为“转基因食品”(Genetically Modified Foods，GMF)。然而转基因生物体在给人类带来福利的同时，也可能给人类健康或生态环境带来风险。转基因生物体引发的生物安全问题包括转基因生物体对人类健康的安全性问题和对自然生态环境的安全性问题。在市场经济背景下，对转基因生物技术及其产品开发、研究和市场化存在着较大的经济刺激和驱动因素，从而导致转基因生物技术及其产品的发展存在受商业利益支配的倾向。由于转基因生物体的大规模环境释放和转基因食品商品化生产可能会带来一定的环境风险与健康隐患，所以需要对转基因作物做进一步研究。虽然现在还不能最后确定转基因技术(包括转基因食品)的安全性问题，但其对生态环境和人类健康的潜在风险不应低估，防范于未然很有必要。

由于转基因生物安全性为人们所关注，各国均要求对进口的转基因食品进行严格的安全检测，确保生物安全和消费者的利益。我国已开始对转基因生物实施安全评价和标识管理，但目前对转基因食品安全性评价和管理体制还处在起步阶段，现有的检验鉴别技术无法满足各级检测机构对转基因食品中各种影响安全性的因素进行全面准确的测定要求。

植物性转基因食品的检测采用的技术路线有两条，一是应用PCR、Southern杂交检测插入的外源基因，该手段主要基于PCR技术和核酸探针的杂交检测技术能精确、快速地检测GMO中是否有外来基因(包括目的基因、标记基因和引物)；二是应用ELISA、Western杂交检测表达的重组蛋白，主要采用化学分析、凝胶电泳和酶联免疫的方法，检测工作较为繁杂。目前，美国和欧盟国家主要采用PCR扩增技术对转基因产品进行检测，使用化学分析方法的较少。PCR技术应用于转基因食品的检测，其敏感快速简便的特点是其它检测技术所无法比拟的。此外，转基因食品的检测还发展了定量PCR，用于确定样品中GMO百分比。虽然荧光定量PCR技术可获得DNA模板的准确定量结果，但定量PCR检测仪价格昂贵，相当多的实验室只能是望而却步。随着现代转基因技术的发展，转基因食品中所含的转基因成分越来越多，当食品中含有未知转基因成分时，就需要对每种耙序列分别进行检测，才能最终确定食品中所含的转基因成分。这个检验过程需要进行多次PCR反应，不仅花费较多时间，检验成本也很高。近年来，发展起来多重PCR技术，可以在一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。

有关转基因生物体检测方法大体可以分为以测定核酸为基础与测定蛋白质为基础两种。不同的方法有不同的特点，综合而言，以测定核酸为基础 的PCR法可用于加工食品，检测范围比以测定蛋白质为基础的免疫学方法要宽，故应用更为广泛。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；这是模板DNA的变性步骤；模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，这是模板DNA与引物的退火(复性)步骤；DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，这是引物的延伸步骤。通过重复循环变性——退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。