[发明专利]使用纳米脂质体免疫佐剂制备抗小分子物质抗体的方法

说明书

技术领域

本发明专利属于免疫学技术领域，具体涉及制备抗小分子物质抗体的方法。

背景技术

抗原是能够刺激动物机体产生免疫应答的外源性物质。免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂，本身不具抗原性，但同抗原一起注射到机体内能增强免疫效果。免疫佐剂的生物作用包括：(1)改变了抗原的物理性状，使抗原物质缓慢地释放，延长抗原的作用时间；(2)增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；(3)佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；(4)佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用。

脂质体生物靶向技术因其“人工生物膜”与细胞膜的高度亲和性，以极强的穿透力进入靶细胞内发挥作用，已被世界医药界称为“二十一世纪生物导弹”。在疫苗研究领域，脂质体由于其在体内能够迅速被免疫细胞捕获，体现出令人瞩目的高效靶向作用，已经被看作一种颇具前景的新型免疫佐剂而被业界寄以厚望。脂质体包封抗原可使抗原延缓释放，并且脂质体颗粒有刺激机体免疫反应的作用。作为一种新型佐剂，脂质体在疫苗领域获得了成功。

能够刺激动物免疫系统产生抗体的物质称为抗原，抗原一般需要有大于10000Da的分子量和复杂的结构。分子量小于1000的物质只能被抗体识别而不能刺激产生抗体，这样的物质称为半抗原。要产生针对小分子半抗原物质的抗体，必须把其共价偶联到大分子载体上构成人工免疫抗原，免疫动物产生针对小分子物质的抗体。而有的小分子物质进入动物体内后不稳定或容易受其它因素的干扰，采用传统的乳化佐剂难以产生高滴度的抗体。

把抗原包埋在纳米脂质体内部，通过静脉注射对动物进行全身系统免疫，刺激动物免疫系统产生高滴度的特异性抗体。脂质体双分子层隔绝生物体内酸、酶、金属离子等因素对所包埋抗原的作用，有效防止其的分解、变性、失活；通过静脉注射，脂质体进入体内迅速汇集到动物中枢免疫系统，能够快速产生免疫应答；这些优点很适合制备针对小分子物质的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是把偶联小分子物质的人工免疫抗原包埋在脂质体内，注射到动物体内进行免疫。脂质体双分子层隔绝生物体内酸、酶、金属离子等因素对所包埋抗原的作用，有效防止其的分解、变性、失活；通过静脉注射，脂质体进入体内迅速汇集到动物中枢免疫系统，能够快速产生免疫应答；这些优点很适合制备针对小分子物质的单克隆抗体。

在制备小分子物质(兽药、真菌毒素等)抗体的过程中，需要把小分子化学偶联到蛋白质载体上，合成人工抗原增加小分子物质的免疫原性，然后免疫动物产生针对小分子物质的抗体。

一些小分子物质经过化学修饰连接到蛋白质后，稳定性降低。另一方面，当人工抗原进入动物体内，pH、酶、金属离子等因素会对一些小分子物质产生影响。传统的免疫途径使用乳化佐剂与抗原混合，对动物进行皮下多点注射免疫，需要较长时间抗原才能被捕获、加工、提呈，继而刺激免疫系统产生抗体。如果缩短抗原提呈过程，稳定性低的小分子物质分解可能性降低，人工抗原受pH、酶、金属离子等因素影响减少，产生特异性抗体的机会增加。

本发明是通过以下技术方案实现的。

使用纳米脂质体作为新型免疫佐剂，包埋偶联小分子物质的人工抗原免疫动物，进入动物体内后快速实现抗原提呈产生特异性免疫应答。使用脂质体免疫佐剂包埋小分子人工免疫抗原，免疫动物产生特异性抗体的各个步骤如下：

(1)将包埋材料大豆卵磷脂和胆固醇以1.8-2.5/1的重量比混匀，再以W/V为1/500-800的比例溶解于二氯甲烷溶剂中，加入到圆底烧瓶，在旋转蒸发器上35-40℃减压蒸干，使大豆卵磷脂和胆固醇贴在容器壁上形成双分子层薄膜；

(2)在圆底烧瓶中加入浓度为1.5-2.0mg/mL、与包埋材料的物料比为2.0-2.5/1的抗原溶液，强烈晃动，包埋材料分散到溶液中并在表面张力作用下收缩成球状脂质体，把部分的抗原包埋到脂质体内部，其中缓冲液用pH＝6.8-7.2的20mM的PBS；使脂质体的粒径控制在合适范围并获得高抗原包封效率。粒径和对小分子人工免疫抗原的包封效率，是影响免疫效率的两个关键的因素，脂质体的粒径控制在50-100nm，以包封在脂质体的小分子人工免疫抗原的比例为35-50％。