[发明专利]一种大豆11S球蛋白分离提取方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种大豆11S球蛋白分离提取方法。

背景技术：

目前分离11S球蛋白的方法主要有Saios法、Thanh法和Nagano法。Thanh法由于操作简单并能大规模分离，许多研究者都采用该法制备11S组分。陈学玲等研究不同缓冲液对Thanh法总蛋白提取率的影响时，认为Tris-HCl缓冲液效果好，接着对Thanh法的改进方面比较了提取时间、料液比、提取温度三因素的影响效果，认为三因素的主次关系为：提取温度＞提取时间＞料液比，且最佳组合为提取时间2h、料液比1∶20、提取温度25℃^[5]。这些传统的方法虽然可同时考虑几种因素，并寻求最佳因素水平组合，但这些实验中难于确定因素之间的交互作用，不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，即回归方程^[6-7]，因而影响提取参数的准确性，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。响应面分析法是通过中心组合实验研究几种实验因素间交互作用的一种回归分析方法，具有实验次数少、周期短，求得回归方程精度高等优点，并从图形方面分析寻求最优实验考察因素值。

发明内容：

在分析比较了一般的Thanh法分离提取大豆11S球蛋白得率较低之后，发明人利用先进的响应面分析法对Thanh法的分离提取11S球蛋白采用的缓冲液、料液比、提取温度、提取时间四个条件进行了优化。确定了大豆11S总蛋白提取的理想工艺条件为：以Tris-HCl缓冲液为溶剂，料液比1∶21，提取温度19.15℃，提取时间1～1.5h。

有益效果：本发明的大豆11S球蛋白分离提取得率较Thanh法提高80％。

具体实施方式：

1.材料

原料豆粕粉碎过70目筛；

试剂：Tris，HCl，考马斯亮蓝G-250，牛血清蛋白(BSA)

2.主要试验仪器

磁力搅拌器，分光光度计，离心机

3.方法

第一步：0.03mol/L pH 8.0Tris-HCl(内含10mmol/L 2-巯基乙醇)缓冲液配制

(1)配制0.6mol/L Tris：称取72.6g Tris加蒸馏水溶解后定容至1000毫升；

(2)配制0.6mol/L HCl：吸取49.8ml HCl用蒸馏水定容至1000毫升；

(3)配制0.03mol/L pH 8.0Tris-HCl：0.6mol/L Tris 50ml+0.6mol/L HCl 26.8ml+0.7ml 2-巯基乙醇加蒸馏水至1000ml。

第二步：分离提取

原料豆粕与pH 8.00.03mol/L Tris-Hcl缓冲液按1∶21料液比于19℃搅拌提取1～1.5h，然后于5000r/min离心20min，取上清用2mol/L HCl调pH值至6.4，4℃静置过夜，次日取出后4℃、10000r/min离心20min，沉淀物即为11S球蛋白。

4.检测

采用考马斯亮蓝G-250法(李建武.生物化学实验原理和方法[M].北京：北京大学出版社，1991)测定蛋白质的含量。

标准曲线的制作：准确吸取1000μg/ml的牛血清蛋白0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1ml，分别放入10ml试管中，加入5.0ml考马斯亮蓝G-250，再用生理盐水补充至6.0ml，2min后于595nm处测其吸光度(标准曲线为Y＝0.0013x-0.0095，R²＝0.9994)。

样品中蛋白质浓度的测定：取1ml总上清液定容至10ml，然后从中吸取1ml按照标准曲线的操作，在595nm处测其吸光度值。