[发明专利]聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的改进方法。

背景技术

乳酸(Lactic acid)，又名2-羟基丙酸，分子式CH₃CH(OH)COOH，是重要 的有机酸之一，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中，是食品工业中常用的 酸味剂和防腐剂，也是医药、化工、皮革、香料等工业的重要的原料。L-乳酸 做为环境友好的生物可降解材料聚L-乳酸(PLA)的原料，国内外对乳酸的需 求量日益增加，发展前景十分广阔。乳酸的来源主要是化学法合成和微生物发酵 生产。由于采用发酵法生产，碳源利用率很高，甚至可以达到100％，并且可以 转化利用作物秸秆以及林业废料等可再生资源，因此国内外普遍使用微生物发酵 法来生产乳酸。

米根霉(Rhizopus oryzae)由于具有产物光学纯度高、营养消耗简单、产物 易于分离等特点而成为生产高光学纯度L-乳酸的理想菌株。但是由于米根霉菌 丝比较发达，在通常的搅拌发酵罐中容易纠结成团和缠住搅拌轴，从而增加了传 质阻力和动力消耗。许多工艺方法如表面生物转盘法、电渗析法和离子树脂等用 于解决上述问题，但大都较复杂或成本太高，不利于规模化工业生产。相对而言， 固定化技术是一种有利于发酵与分离耦合的生物反应技术，能提高微生物的耐性 和利用率，能减少后期分离的工艺过程。目前适用于米根霉固定化的方法有吸附 法、自絮集法和包埋法。吸附法中的菌丝体易脱落，自絮集法不易控制固定化细 胞的大小。因此包埋法具有更广泛的用途。包埋法所用的固定化载体有聚乙烯醇 (PVA)、海藻酸钠、聚丙烯酰氨(ACAM)、聚乙烯乙二醇(PEG)、琼脂、聚 胺酯泡沫、角叉菜胶和聚丙稀酸等凝胶。海藻酸钠是最普遍的固定化载体，但其 机械强度不高易破碎。聚丙烯酰氨等对细胞毒性比较大。聚乙烯醇(PVA)具有 强度高，化学稳定性好，抗微生物分解性强，且价格低廉等一系列优点，是一种 较为理想的包埋固定化载体，已应用于多种微生物的固定化。但常规的PVA- 硼酸法制得的凝胶珠的通透性差，凝胶颗粒间易结团成块，且硼酸对生物毒性大， 细胞活性会受到影响。因此，对常规的PVA-硼酸固定化米根霉方法进行改进 是十分必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的聚乙烯醇球状载体以及通透性差的 缺点，提供一种改进的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法。

为解决上述问题，本发明的技术方案为：

一种聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：将聚乙烯醇 和海藻酸钠于沸水浴加热共溶于水，与米根霉孢子悬液混合，将混合液滴入含有 3-5％氯化钙的饱和硼酸溶液中，同时不停搅拌，使颗粒成球形，好的固定化颗粒 于低温下硬化，然后用磷酸二氢钠溶液浸泡处理，然后用水洗涤除去颗粒内生成 的海藻酸钙，得到的聚乙烯醇固定化米根霉细胞进行增殖培养生长后，用蒸馏水 洗净，用于L-乳酸的分批和重复分批发酵。

所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：米根霉孢 子悬液中聚乙烯醇的浓度为4-10％，海藻酸钠的浓度为0.4-2％；所述的饱和硼 酸溶液中含有2％氯化钙，其pH值为5.0-6.0；接入米根霉孢子悬液与聚乙烯 醇和海藻酸钠混合液的体积比为1∶2-10；磷酸二氢钠溶液的浓度是 0.2-0.4mol/L，浸泡处理时间是0.5-2小时。

所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：米根霉孢 子悬液中聚乙烯醇的浓度为6％，海藻酸钠的浓度为0.8％；接入米根霉孢子悬 液与聚乙烯醇和海藻酸钠混合液的体积比为1∶3.3；磷酸二氢钠溶液的浓度是 0.3mol/L，浸泡处理时间是0.5-1小时。

所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：固定化颗 粒于4℃下硬化24小时。

所述的聚乙烯醇固定化米根霉发酵L-乳酸的方法，其特征在于：得到的聚 乙烯醇固定化米根霉细胞进行增殖培养生长后，用蒸馏水洗净，用于L-乳酸的 分批和重复分批发酵的具体步骤是：

(1)增殖固定化米根霉细胞：增殖培养基中接入20％(v/v)固定化细胞，增殖 条件为150r/min，37℃下增殖24小时；

(2)接种量的确定：接种量为20％(v/v)；

(3)发酵温度确定：发酵温度为38℃；