[发明专利]抑制人hRAD21基因表达的siRNA和表达质粒及其在制药中的应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种特异性抑制人hRAD21基因表达的siRNA及该siRNA的表达质粒和它们在制备治疗或预防与人hRAD21基因有关的肿瘤的药物中的应用。本发明利用生物计算机信息技术从GenBank中获得一组人hRAD21基因序列，并以RNA干扰技术为基础，设计出一组能诱发hRAD21RNA干扰的siRNA，通过化学法合成或质粒载体表达一定量的siRNA，从而特异性抑制人hRAD21基因的表达。达到抑制肿瘤的发生和生长的目的。该siRNA及其表达质粒可用于制备治疗端粒酶阴性和端粒酶抑制剂耐受的恶性肿瘤的特异性药物。

发明背景：

端粒(telomere)是染色体末端由DNA与调节蛋白组成的特殊复合体，具有防止染色体末端降解、融合而起到保护染色体完整性、维持细胞稳定性的作用。端粒随正常细胞的有丝分裂而逐渐缩短，至一定程度后发生凋亡，因此端粒被称为细胞生命的时钟。恶性肿瘤细胞必须维持一定的端粒长度才能达到持续分裂和生长的目的。约85％或稍多的癌细胞依靠端粒酶(Telomerase)来维持端粒长度和细胞永生。研究显示，还有约15％的肿瘤细胞并不依赖端粒酶来维持端粒长度，这些细胞也具有无限分裂的能力，但却不能检测到端粒酶活性。学术界将这种端粒维持机制定义为端粒替代延长机制(Alternative lengthening of telomeres，ALT)，或称为不依赖端粒酶的生长旁路。

不依赖端粒酶的ALT旁路的肿瘤细胞的端粒长度不一致，其末端重复序列长度变化范围大(从＜2kb到＞20kb)，而且研究表明ALT的出现与已知癌基因、抑癌基因变异或致癌方式无关。人类ALT细胞的另一个重要特征是存在一种特殊的核蛋白复合体，称为ALT相关的早幼粒细胞白血病(PML)小体，简称APB小体。APB小体由端粒DNA、端粒结合蛋白(如TRF1和TRF2)、PML小体以及一系列参与DNA重组与修复的蛋白组成。研究表明，APB小体仅在ALT细胞中出现，并为ALT细胞维持端粒长度提供了所需的功能分子和场所。

恶性肿瘤的ALT旁路是端粒酶研究中的一个重要的未知问题和领域，是探讨恶性肿瘤生物学特性和永生机制的重要基础，也是开展以端粒酶为治疗靶点的生物治疗前乃至化疗前需要了解的问题。端粒酶抑制剂是一类特异性强，毒性小的较理想的新一代抗肿瘤药物，是最具前景的肿瘤治疗方向之一。但是，端粒酶抑制剂对于端粒酶阴性的人类肿瘤是无效的，并且，研究证实，应用端粒酶抑制剂治疗端粒酶阳性的肿瘤时会使部分端粒酶阳性的肿瘤激活ALT机制而产生端粒酶抑制剂逃避现象。因此，研究ALT旁路特异性抑制剂是对于治疗端粒酶阴性的恶性肿瘤以及产生端粒酶抑制剂逃避的恶性肿瘤具有重要意义。

本说明书的第一个目的是提供一种用于制备ALT旁路特异性抑制剂的分子靶点，即hRAD21基因和/或蛋白。

本发明所述的hRAD21是指裂殖酵母RAD21基因的人类同源物，也称为姐妹染色体蛋白1(SCC1)，是姐妹染色单体粘连复合物(cohesin)的成分之一。目前认为其功能是参与真核细胞有丝分裂过程中新复制的姐妹染色单体的有效分离以及DNA双链断裂损伤的重组修复过程。

本发明通过对比ALT细胞系与端粒酶阳性细胞系中的RAD21的mRNA和蛋白水平的表达情况，证实了ALT肿瘤细胞中hRAD21基因和蛋白的表达显著上调。本发明通过双色免疫荧光共定位技术证实了hRAD21蛋白是人类ALT恶性肿瘤细胞中APB小体的组成成分，从而证实了hRAD21基因和/或蛋白是参与ALT机制的重要功能分子。

本发明的第二个目的是提供一种特异性抑制hRAD21基因表达的siRNA。

本发明的第三个目的是提供上述siRNA的表达质粒。

本发明的第四个目的是提供上述siRNA或产生该siRNA的表达质粒在制备抗肿瘤药物中的应用。

发明内容：

按照实施例1，本发明提供了一种用于制备ALT旁路特异性抑制剂的分子靶点，所述的分子靶点是指hRAD21基因和/或蛋白。

本发明提供了一种特异性抑制hRAD21基因表达的双链DNA oligos序列。

所述的双链DNA oligos序列如下所示：

1#：

5‘GATCCCGCCCATGTGTTCGAGTGTATTCAAGAGATACACTCGAA

CACATGGGCTTTTTGGAT