[发明专利]对蚊子等双翅目昆虫有杀虫活性的Bt cry40Dal基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属微生物基因工程技术领域，亦属于生物防治技术领域，具体涉及一种来自苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因克隆，在宿主细胞(工程菌)中的诱导表达及其在生物防治领域的应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis，简称Bt)能产生对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫具有高毒杀作用的杀虫晶体蛋白(又称-内毒素)。杀虫晶体蛋白在Bt菌株形成芽孢生成期间形成，并形成伴孢晶体，是由cry基因和cyt基因编码。自Schnepf等1981年首次从Bt中克隆cry基因，现在已有400余种杀虫蛋白基因(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html)。Hofte和whiteley1989年Hofte和Whiteley根据晶体蛋白的氨基酸序列和杀虫谱的不同，将已经发表的42种Cry蛋白分为4群13亚类。现在分类原则是根据杀虫晶体蛋白的氨基酸序列同源性，Neil Crickmore为首Bt内毒素命名委员会将它们分为为57大类。

不同种类的Cry蛋白不仅杀虫范围不同，而且大小也不一样，大致有三个区域范围：129-138KD、65-67KD和25-28KD。它经特定蛋白酶的水解作用后，释放有活性的毒性肽核心片断(toxincore fragment)，然后与敏感昆虫消化道刷状缘膜囊(brush border memberance vesicles，BBMV)上的受体不可逆特异的高亲和结合，快速插入细胞质膜形成穿孔(pore)或病灶(lesion)。引起细胞膜非极化，离子梯度的破坏，扰乱了细胞内外正常的跨膜电势，及破坏细胞的酸碱平衡。另外Bt在敏感昆虫的血腔迅速增值会导致昆虫的败血症。一般认为内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入和孔洞或离子通道形成等五个环节。

蚊虫、蝇等双翅目昆虫吸血叮人，不仅扰乱人们的工作和睡眠，而且传播疟疾，丝虫病，登革热，黄热病及乙型脑炎等多种疾病，其以疟疾和乙脑危害最为严重，目前世界上约有5亿多人口遭受疟疾的威胁，严重危害人类健康。以前一般利用化学农药控制蚊虫生长繁殖，但长期大量使用，不可避免地造成环境污染，并使害虫产生抗性。控制蚊虫现在人们把眼光都转向生物农药，在1976年，Goldberg等发现了Bt0NR260菌株对蚊虫具有很强的杀虫活性。这种菌株属于一种新的血清型并被命名为Bt以色列亚种(Btsubsp.israelensis)，在它的包涵体中发现了多种杀虫晶体蛋白成分(Goldberg L.J.，Margalit J.Mosq.News，1977，37(3)：355～358)。苏云金芽孢杆菌以色列亚种作为生物杀虫剂成功地用于蚊虫和蚋等多种双翅目昆虫的控制已有多年，在疟疾，登革热，黄热病和丝虫病等蚊媒疾病的控制上发挥了重要的作用(李洁，张应阔，钱万红.昆虫知识，1997，34(2)：109～111)。近年来，在巴西，印度，法国，尼日利亚，塞内加尔等地，Bti已广泛地用于蚊幼虫孽生地的控制，取得了良好的应用防和治效果。

作者从中国广西百色大王岭自然保护区收集了大量微生物土壤样品，从中分离到一株高产椭圆形晶体蛋白的Bt菌株，命名为Bt S2096-2(见附图1)。本发明建立了PCR-RFLP方法鉴定该Bt菌株cry40基因的鉴定体系，然后利用PCR方法获得获取了Cry40Da基因全基因序列，该基因苏云金芽孢杆菌国际命名委员会确认为一个新的cry模式基因，命名为cry40Da1基因。Cry40Da1基因并在大肠杆菌中表达，其表达产物对三龄致倦库蚊具有相当毒力。本发明的意义在于从野生的Bt菌株S2096-2中分离克隆了杀虫晶体蛋白基因Cry40Da，转化到大肠杆菌表达，表明Cry1Ac22蛋白对库蚊双翅目昆虫有相当的杀虫活性，菌株Bt S2096-2的cry40Da1基因克隆为构建杀蚊工程菌提供一种候选基因。

发明内容

本发明的主要内容是分离和克隆了一种对蚊子等双翅目昆虫有高效杀虫活性的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白模式基因cry40Da1，重组工程菌的构建，在宿主细胞(工程菌)中的诱导表达，目标蛋白的分离纯化及其在生物防治领域的应用。

本发明提供了一种苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry40Da1，具有如下所示的核苷酸序列：a)如SQE NO：1所示的核苷酸序列；b)与SQE NO：1所示的核苷酸序列具有兼并性的核苷酸序列；c)与SQE NO：1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的核苷酸序列。