[发明专利]DNA分析装置

说明书

技术领域

本发明涉及DNA碱基序列确定装置和DNA碱基的种类鉴定装置等DNA 分析装置，以及基因诊断装置。

背景技术

DNA碱基序列确定中，利用凝胶电泳和荧光检测的方法被广泛使用。就 该方法来说，首先，大量制作要进行序列解析的DNA片段的复制品。以DNA 的5’末端为起点，制作各种长度的荧光标记片段。另外，根据这些DNA片段 的3’末端的碱基种类，附加波长不同的荧光标记。通过凝胶电泳，以1碱基的 差异识别长度的不同，检测各片段组发出的光。由发光波长获知测定中的DNA 片段组的DNA末端碱基种类。因为DNA是从短的片段组开始顺次通过荧光 检测部，所以通过计测荧光色，可以由短的DNA开始顺次获知末端碱基种类。 由此进行序列确定。这种荧光式DNA测序广泛普及，并且在人类基因组解析 中也广泛使用(参照非专利文献1)。另一方面，正如2003年宣告的那样，人 类基因组序列解析结束，将序列信息应用于医疗、各种产业的时代已经到来。 于是，很多情况是不必解析长DNA的全部而仅知道目标的短DNA序列就足 够了。这需要简便廉价的装置。进而，同时对非常多的DNA片段进行序列解 析的要求也多起来。这种DNA序列解析需要简便且能够扩张的方法、装置。

作为应对这种要求的方法而产生的技术，有以焦磷酸测序为代表的通过阶 段性化学反应进行的序列确定。该方法中，使引物与作为靶的DNA链杂交， 将4种互补链合成核酸底物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)1种1种地顺次加 入反应液中，进行互补链合成反应。一旦互补链合成反应发生，则DNA互补 链延伸，生成作为副产物的焦磷酸(PPi)。焦磷酸在共存的酶的作用下转化成 ATP，在萤光素和萤光素酶的共存下进行反应，产生发光。通过检测该光，获 知加入的互补链合成底物被组入了DNA链，获知互补链的序列信息，从而获 知作为靶的DNA链的序列信息(参照非专利文献2)。最初的焦磷酸测序的方 法如下(参照专利文献1)。即，将DNA固定在柱中间，使含互补链合成底物 的溶液流过，从而使作为反应生成物的焦磷酸通过几个反应部。在该过程中， 焦磷酸转化为ATP，使用采用了萤光素和萤光素酶的发光体系得到发光，对其 进行检测(参照非专利文献3)。

另一方面，Nyren等人利用三磷酸腺苷双磷酸酶等酶将反应中没有被使用 的互补链合成底物快速分解，以便对接下来的反应步骤没有影响(参照专利文 献2、3)。该方法只要简单地将试剂顺次加入反应槽即可，是更简单的方法。 萤光素＝萤光素酶发光体系中，不仅ATP，作为互补链合成底物的dATP也作 为发光底物发挥作用。因此，正在使用不成为发光底物的类似化合物dATPαS (参照专利文献4、5，非专利文献4)。

进而，本发明人等，通过使用PPDK代替以往使用的ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)来作为由焦磷酸生成ATP的反应相关的酶，采用由焦磷酸和AMP 生成ATP的工艺，减少背景发光，开发出了以高灵敏度检测DNA序列的方法 (参照专利文献6、非专利文献5)。

另外，该方法也适于将大量DNA样品平行地进行序列解析，报道了设计 数万至数百万的反应单元来平行进行序列解析的尝试(参照专利文献7、非专 利文献6)。

专利文献1：美国专利第4863849号说明书

专利文献2：美国专利第4971903号说明书

专利文献3：美国专利第6258568号说明书

专利文献4：美国专利第6210891号说明书

专利文献5：日本专利第3510272号公报

专利文献6：日本特开第2007-097471号公报

专利文献7：WO2005/003375

非专利文献1：現代化学，2004年7月号，vol.400，66-69

非专利文献2：Electrophoresis，22，3497-3504(2001)

非专利文献3：Analytical Biochemistry 174，423-436(1988)

非专利文献4：Analytical Biochemistry 242，84-89(1996)

非专利文献5：Analytical Chemistry，78，4482-4489，(2006)

非专利文献6：Nature，437，376-380(2005)

发明内容