[发明专利]一种具杀菌活性的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白的制备及应用

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，涉及栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白(Cf-PGRP)基因编码区的体外重组表达技术，活性重组蛋白的分离纯化，以及重组蛋白对枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌的杀菌抑菌作用研究；还涉及到该重组蛋白作为一种新型抗菌药物及免疫增强剂，饲料添加剂生产中的应用价值。

背景技术：

非已识别是固有免疫的起始步骤，也是免疫学研究的根本问题。无脊椎动物缺少获得性免疫，因此，固有免疫的非已识别对无脊椎动物具有至关重要的意义。同时，由于微生物种类繁多，并经常发生变异，也增加了非已识别的复杂性。固有免疫非已识别的研究主要是从Janeway和Medzhitov在1998年提出的病原体相关分子模式和模式识别受体这两个概念的基础上发展起来的。

病原体相关分子模式(PAMPs)是一类或几类病原体所共有、对其生存绝对必要且宿主机体没有的保守成分。它包括G^-菌的脂多糖(LPS)、类脂A，G⁺菌的肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，分枝杆菌和疏密螺旋体的脂蛋白与脂肽，酵母菌和支原体的某些成分等。

PAMP是固有免疫识别的理想靶标，而且数量并不多，因此宿主通过有限数量的胚系编码基因就能够识别很多类的微生物。这类由胚系基因编码的，在机体内不断进化识别PAMP的受体，即被称为模式识别受体(PRRs)。模式识别受体和病原体相关分子模式这两个概念的提出及后续的研究实例，揭示了固有免疫识别分子的作用本质就是通过识别病原体所特有保守性分子模式而区别对宿主机体有害或无害物质，并选择合适方式清除有害物质，因而具有重要的免疫生物学意义。

肽聚糖识别蛋白家族(PGRPs)是重要的模式识别受体，从昆虫到人类均高度保守，根据结构的差异，肽聚糖识别蛋白可以分为三个亚家族：长型亚家族(L)、中间型亚家族(I)和短型亚家族(S)。短型PGRP基因属于分泌型胞外蛋白，具有典型的信号肽，分子量在20kDa左右，PGRP结构域紧接在信号肽之后，成熟蛋白只具有1个PGRP结构域。

第一个PGRP蛋白是在家蚕的血淋巴中发现的，它能与肽聚糖结合并能激活酚氧化酶级联反应。在对哺乳动物和昆虫PGRP的研究发现，PGRP对肽聚糖有很强的亲和力，起着胞内或胞外识别分子的功能，它能激活Toll、Imd、酚氧化酶的激活途径，从而引起黑化反应、抗菌肽的活化及促进细胞吞噬等功能。

PGRP蛋白的杀菌机制有两种：一种是由于PGRP与肽聚糖不可逆的结合，从而干扰细菌细胞壁的合成；另一种是一些PGRP具有酰胺酶活性，可以降解肽聚糖，从而破坏细胞壁使菌体破裂，这种杀菌作用类似于青霉素。人的PGRP-S、PGRP-Iα和PGRP-Iβ有抗菌作用，其他哺乳动物PGRPs也被报道有杀菌或抑菌活性。Dziarski R等发现大鼠的PGRP-S具有抑制革兰氏阳性菌生长的作用，PGRP-S基因敲除后的大鼠对革兰氏阳性菌的易感性增加。在人的PGRPs4个成员中，人们只发现PGRP-L具有酰胺酶活性，人PGRP-L Cys的一个突变体能够使PGRP-L丧失酰胺酶活性。Gelius E等发现大鼠的PGRP-L也具有酰胺酶活性。Sashchenko LP等发现大鼠PGRP-S与体液或淋巴细胞内的Hsp70能形成一个稳定的细胞毒素复合体，在极低的浓度下就能导致机体死亡。Kappeler SR等发现骆驼的PGRP识别乳酸菌，在链球菌感染时能够上调其表达，但在乳腺发炎的情况下却不出现此现象，这似乎说明了在骆驼奶中这种蛋白的主要作用是抑制乳酸菌的生长。

本发明中的栉孔扇贝Cf-PGRP为短型肽聚糖识别蛋白，其重组产物对革兰氏阳性菌具有很强的抗菌功能。目前，肽聚糖识别蛋白的结构和功能在昆虫和哺乳动物中已得到一定程度的研究，但在水产养殖动物中的研究还很少。PGRPs在水产养殖动物中的研究，有利于更好的揭示固有免疫作用的途径及其工作机制，广谱抗菌药物和免疫增强剂的筛选提供指导。

发明内容：

栉孔扇贝作为软体动物的代表，在进化上比较原始，研究其模式识别作用具有重要的意义。本发明对栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白(Cf-PGRP)基因编码区进行原核重组，旨在确认其蛋白功能，以深入研究Cf-PGRP受体蛋白的杀菌抑菌活性及其广谱性，为抗菌药物和免疫增强剂的筛选提供指导。