[发明专利]基于erbB2蛋白胞外区C-端功能表位特征设计抗erbB2功能抗体

说明书

技术领域

本发明涉及基于erbB2蛋白胞外区C-端功能表位结构特征设计获得新型抗erbB2人源抗体。具体而言，即利用erbB2晶体结构模型以及其功能抗体Herceptin识别的表位(erbB2蛋白胞外区C-端)特征，通过计算机辅助分子设计方法获得一种抗erbB2人源抗体；经生物信息学相关手段进行反向翻译确定其合适的基因结构，应用分子生物学技术进行基因全合成，并通过细胞生物学实验对抗体的功能进行评价。 

背景技术

作为表皮生长因子受体家族(ErbB家族)成员，erbB2(HER2，HER2/neu)是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。erbB2的分子结构可分为胞外域、跨膜域和胞内域三部分，其中胞外域又可分为D1、D3两个极相似的由β片层围成的桶状结构域和D2、D4两个富含半胱氨酸的结构域，胞内部分具有酪氨酸激酶活性。 

大量研究结果显示，erbB2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中过表达。免疫组化染色可见乳腺癌细胞的erbB2水平较正常乳腺细胞高10～100倍。因此erbB2是 肿瘤免疫治疗的理想靶分子。 

1998年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准由Genetech公司开发的靶向erbB2的人源化单克隆抗体Herceptin(罗氏公司产品，注射用曲妥珠单抗，又称赫赛汀，英文名Trastuzumab)上市，应用于ErbB2过表达的乳腺癌患者的临床治疗。目前，Herceptin已成为广泛应用于转移性乳腺癌的一线临床治疗药物。 

然而，一系列临床试验表明，Herceptin的疗效有限，单独应用其有效率仅为11.6～16％，与化疗药物联合治疗的有效率可达50％，不过，联合用药可导致明显的心脏毒性；与此同时，Herceptin昂贵的治疗费用也令第三世界国家的普通患者难以承受。因此，研发新的靶向erbB2人源抗体具有重要的临床和研究意义。 

伴随着计算机辅助分子设计方法的不断完善以及本单位提出的“基于抗原-抗体相互识别立体结构信息设计新功能分子”方案，在获得的erbB2晶体结构的基础上，本项发明通过erbB2胞外区C-端结构域的构象特征，从理论上获得了一系列抗erbB2抗体分子，并通过实验进行了评价。 

发明内容

为了提供新的抗erbB2抗体分子，本发明公开了一组抗erbB2人源抗体，其特征在于重链可变区氨基酸序列选自SEQ_ID NO：1、SEQ_ID NO：2、SEQ_ID NO：3、SEQ_ID NO：4、SEQ_ID NO：5或SEQ_ID NO：6；其轻链可变区氨基酸序列选自SEQ_ID NO：7、 SEQ_ID NO：8、SEQ_ID NO：9、SEQ_ID NO：10、SEQ_ID NO：11或SEQ_ID NO：12。 

本发明公开的抗erbB2抗体是基于erbB2蛋白胞外区C-端功能表位特征利用计算机辅助设计获得的抗体。 

本发明公开的抗体的一个特征是能特异性识别靶抗原：设计获得的抗体能够与重组蛋白erbB2特异性结合。 

本发明获得的抗体的一个特征是能够特异性识别抗原表位：结合erbB2胞外区含有C-端功能表位的N-端缺失突变体erbB2-C，而与erbB2胞外区含有N-端功能表位的C-端缺失突变体erbB2-N不反应。 

本发明公开的抗体的一个特征是设计获得的抗体能特异性地抑制erbB2阳性的SKOV3、MCF7以及SKBR3等肿瘤细胞增殖。 

本发明公开的抗体的一个特征是设计获得的抗体能介导ADCC活性，特异性杀伤erbB2阳性的SKOV3、MCF7以及SKBR3等靶细胞。 

本发明还公开了通过计算机辅助分子设计获得的抗erbB2人源抗体的设计流程(图16)。 

具体实施过程如下： 

1)抗原erbB2晶体结构及C-端功能表位结构特征分析； 

2)利用计算机辅助分子设计获得的人源抗erbB2抗体可变区结构； 

3)抗erbB2抗体与erbB2作用复合物结构模拟； 

4)利用全合成PCR技术合成抗erB2抗体基因； 

5)抗体的表达及鉴定 

6)抗erbB2抗体生物学活性鉴定。 

下面参照上述步骤详细描述抗erbB2人源抗体的设计及制备过程。设计及制备本发明抗体的方法仅仅是说明相关方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。