[发明专利]通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生

说明书

本申请是申请日为2001年01月26日、申请号为01806451.5、 发明名称为“通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪 酸的脂质的产生”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及培养微生物和回收微生物脂质的新方法。具体地，本发明 涉及生产微生物多不饱和脂。

发明背景

在真核微生物中生产多烯脂肪酸(含有2个或更多个不饱和碳碳键的脂 肪酸)一般认为需要分子氧的参与(即需氧条件)。这是因为据认为在所有非 寄生性真核微生物的脂肪酸中形成的顺式(cis)双键参与直接的氧依赖型去 饱和反应(氧化微生物去饱和酶系统)。其它已知需要分子氧的真核微生物脂 质包括真菌甾醇和植物甾醇，羟基类胡萝卜素(oxycarotenoids)(即叶黄素)， 泛醌，和从任一种这类脂质制备的化合物(如次级代谢产物)。

已证实某些真核微生物(如藻类；真菌，包括酵母；和原生生物)在发酵 罐中可以很好地生产多烯脂肪酸。但是，极高密度培养(微生物的生物量大 于100g/L，特别是商业规模的)会降低多烯脂肪酸的含量，这样会降低多烯 脂肪酸的生产力(productivity)。这可能部分是由于几种因素，包括由于微生 物的高浓度造成对氧的高需求，而难于维持发酵液中的溶氧水平。保持较 高溶氧水平的方法包括提高通气速率和/或采用纯氧替代空气通气和/或提 高发酵罐的搅拌速度。这些解决方法一般提高脂质生产的成本和发酵设备 的资金成本，而且会产生其它的问题。例如，在高细胞密度时增加通气容 易在发酵罐中产生严重的起泡问题，加强搅拌会由于发酵液中剪切力增加 而导致微生物细胞破碎(这会导致脂质释放到发酵液中，从而被氧化和/或被 酶降解)。对于正处于氮受限或耗尽以诱导产生脂质从而细胞壁较弱的细胞， 细胞破碎问题更为突出。

结果，当以极高细胞密度培养生产脂质的真核微生物时，它们的脂质 通常都只含有极少量的多烯脂肪酸。例如，以醇为碳源培养斯达氏油脂质 酵母(Lipomyces starkeyi)在140小时到153g/L的密度，产生的脂质浓度为 83g/L。但是在浓度大于100g/L时酵母的多烯脂肪酸含量平均只有总脂肪酸 的4.2％(在细胞密度为20-30g/L时其含量从占总脂肪酸的11.5％开始减少)。 Yamauchi等，J.Ferment.Technol.，1983，61，275-280。这样产生的多烯脂 肪酸浓度只有约3.5g/L，平均多烯脂肪酸生产力只有约0.025g/L/hr。此外， 在酵母脂质中唯一报导的多烯脂肪酸是C18:2。

已证实另一酵母，Rhodotorula glutinus，具有的平均脂质生产力约为 0.49g/L/hr，但其脂质中多烯脂肪酸含量也较低(占全部脂肪酸的15.8％， 14.7％ C18:2和1.2％ C18:3)，导致在补料分批培养中多烯脂肪酸生产力只 有约0.047g/L/hr，在连续培养中是0.077g/L/hr。

本发明人之一以前已证实破囊壶菌(Thraustochytriales)目的某些海洋微 藻类在发酵罐中是极好的多烯脂肪酸生产者，特别是在低盐，特别是极低 氯化物水平培养时。其它有人描述了Thraustochytrids在培养120小时，细 胞密度为59g/L时的平均多烯脂肪酸(DHA，C22:6n-3；和DHA，C22:5n-6) 生产力约为0.158g/L/hr。但是这样的生产力只能在约50％的海水盐度下达 到，这样的浓度会严重腐蚀传统的不锈钢发酵罐。

生产含多烯脂肪酸的微生物脂质，特别是高度不饱和脂肪酸，如 C18:4n-3，C20:4n-6，C20:5n3，C22:5n-3，C22:5n-6和C22:6n-3，的费用一 直较高，部分原因是含高水平多烯脂肪酸的真核微生物培养密度的限制和 在这样的高细胞浓度下的氧限制以及获到高生产力所需的较高温度的限 制。

因此，需要高浓度培养微生物，并同时利于提高含多烯脂肪酸的脂质 的产量。

发明概述

本发明提供了培养真核微生物的方法，所述微生物能产生至少约20％ 的生物量的脂质，本发明还提供生产这样的脂质的方法。优选这些脂质包 含一或多种多烯脂肪酸。此方法包括向含有真核微生物的发酵培养基加入 碳源，优选是非醇碳源，和限制性营养源。优选地，所述碳源和营养源的 添加速度足以提高发酵培养基的生物量密度到至少约100g/L。