[发明专利]驱动蛋白样蛋白KIF1B的转移相关功能和预测肿瘤患者预后的标志物用途及其应用方法

权利要求书

1.驱动蛋白样蛋白KIF1B(kinesin family member 1B)，也称CMT2A(Charcot-Marie-Tooth neuropathy 2A)的肿瘤转移相关功能。

2.KIF1B表达水平预测乳腺癌患者预后的标志物用途，其特征在于基于KIF1B表达水平可以预测肿瘤患者的预后。

3.基于KIF1B表达水平预测肿瘤患者预后的检测及应用方法，其特征在于：

(1)定量RT-PCR方法检测KIF1B mRNA表达水平：a.提取肿瘤患者原发癌组织标本的细胞总RNA；以RNA为模板逆转录合成cDNA；以cDNA为模板，定量PCR扩增KIF1B基因，计算基因拷贝数。定量PCR扩增包括相对定量PCR扩增和绝对定量PCR扩增：1)相对定量PCR扩增，即利用KIF1B基因和管家基因(House-keeping gene)的特异性引物和荧光标记探针进行实时定量PCR扩增，计算KIF1B mRNA的相对表达量为2^-ΔCt，其中，ΔCt＝Ct_KIF1B-Ct_{House-keeping gene}(Ct值为实时定量PCR时荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数)；2)绝对定量PCR扩增，即通过同时扩增已知KIF1B基因拷贝数的梯度稀释样本制作标准曲线，计算组织样本中KIF1B mRNA拷贝数。根据肿瘤患者复发转移阳性病例和复发转移阴性病例的KIF1B mRNA相对表达量或绝对表达量，确定其用于预后判断的临界值，KIF1BmRNA表达量高于临界值的患者预后好，而低于临界值的患者预后差。

(2)分子杂交方法检测KIF1B mRNA表达水平：采用KIF1B的cDNA探针或cDNA序列的寡核苷酸探针，与从肿瘤患者肿瘤组织标本中提取的RNA为模板逆转录合成的cDNA或cDNA的扩增产物(cRNA)进行分子杂交，通过杂交后的信号强度确定KIF1B的基因表达量。根据肿瘤患者复发转移阳性病例和复发转移阴性病例的KIF1B mRNA表达量，确定其用于预后判断的临界值，KIF1B基因表达量高于临界值的患者预后好，而低于临界值的患者预后差。

(3)免疫染色方法检测蛋白表达水平：免疫染色包括免疫荧光、免疫组织化学、免疫细胞化学等，利用应该酶标记或荧光标记的抗KIF1B蛋白的特异性抗体与肿瘤组织细胞或细胞裂解液进行免疫反应，通过检测荧光或酶作用底物后的产生的颜色和吸光度值确定癌组织细胞中KIF1B蛋白的表达水平，再依据KIF1B蛋白表达水平预测患者预后。

(4)免疫印迹(Western blot)方法检测蛋白表达水平：是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离裂解后的组织细胞的蛋白质，再将蛋白质转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，然后利用抗KIF1B蛋白特异性抗体与固相载体上的蛋白发生免疫反应，再与酶、同位素或荧光标记的第二抗体起反应，经过底物显色、化学发光或放射自显影检测KIF1B蛋白在组织细胞中的表达量。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于以原发癌组织中KIF1B mRNA或蛋白表达量为某一特定阈值作为对肿瘤患者预后判断的临界值，高于临界值的患者则判断为预后好，低于该临界值则判断为预后差。