[发明专利]破伤风毒素受体结合区Hc在大肠杆菌中的高效表达及应用

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一个破伤风毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白以及作为亚单位疫苗在破伤风预防方面的应用。

技术背景：

破伤风是一种严重危害人民生命健康的疾病，它是由革兰氏阳性、厌氧的梭状芽胞杆菌——破伤风杆菌侵入人体伤口、生长繁殖、产生破伤风毒素引起的一种急性特异性感染，破伤风毒素入侵神经系统可导致人全身性肌肉痉挛，进而全身性衰竭或窒息死亡。一切开放性损伤，均有发生破伤风的可能。破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素，约100ng的破伤风毒素便可以致人死亡。破伤风在广大贫困落后的第三世界国家和地区非常严重。据估计，世界上每年约有100万病例发生，死亡率在50％左右。在发展中国家，新生儿破伤风死亡率高达90％。寻找高效、安全的破伤风预防和治疗药物是各国致力的方向。

破伤风毒素全长1315个氨基酸，分子量为150kD，共由A、B、C三部分组成，每部分分子量均为50kD。C片段是重链的C端，具有结合神经细胞的作用。B片段是重链的N端，具有导入作用。A片段是轻链，有蛋白酶活性，可抑制神经传递物质的释放，具有麻痹作用。传统的类毒素疫苗是破伤风毒素经甲醛脱毒、铝佐剂吸附精制而成的，虽然其免疫效果较好，但仍存在一些问题：接种类毒素后有一定的副反应发生；破伤风梭菌可形成芽孢形式，毒性高，生产疫苗有一定危险性；甲醛处理类毒素容易造成污染；化学处理后的类毒素可能发生毒性逆转；而且重要的是免疫期短，随着年龄的增长，对破伤风免疫力下降，儿童需要4～6年加强免疫，成人需要每10年加强一次免疫。因此，现有的类毒素疫苗还需进一步改进和发展，而开发新型的基因工程疫苗是方向之一。实验已证实用完整的毒素分子进行免疫并不是必需的。破伤风天然C片段(Hc)保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质，免疫效价与毒素相当，无毒性，过敏原性低，是将来发展亚单位疫苗和基因工程疫苗的候选者，已被用于研究亚单位疫苗、细菌和病毒载体疫苗、粘膜疫苗等很多方面。

用大肠杆菌表达抗破伤风毒素的亚单位疫苗具有重要的意义，其工艺简单，重组的Hc蛋白不用担心被完整毒素所污染，其安全性较高，但目前表达的破伤风Hc片段普遍存在表达量较低，易形成包涵体，免疫效价较低等缺点，这是因为Hc序列中AT含量丰富且存在大量的大肠杆菌稀有密码子，这在一定程度上限制了它的表达。国内外许多研究者对破伤风Hc段的表达进行了改进，表达量得到了一定的提高，但仍达不到大量生产的需求，且制备得到的Hc免疫原性与传统类毒素疫苗相比也较低。

为了解决这个问题，本研究拟采用序列及载体优化等手段，对国内破伤风强毒株CMCC64008株(GeneBank No：AF154828)的Hc片段序列进行优化，通过在大肠杆菌中的可溶性高表达制备具有天然构象的亚单位疫苗，并对该疫苗的免疫剂量、免疫效价、保护效果等方面进行研究并进一步探索Tet-Hc作为亚单位疫苗可行性，为下一步深入制备破伤风Hc亚单位疫苗奠定基础。

发明内容：

本发明的目的是提供一个经优化后可以在大肠杆菌中进行高效可溶性表达且能够激发机体对破伤风毒素产生免疫保护作用的破伤风毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白在破伤风亚单位疫苗中的应用。

本发明所提供的破伤风毒素受体结合区Hc基因，名称为Tet-Hc，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No.2的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激发机体对破伤风毒素产生免疫保护作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No.1由1353个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1353碱基，编码具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

所述破伤风毒素受体结合区Hc基因编码的蛋白Tet-Hc，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No.2；

2)将序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有激发机体对破伤风毒素产生生免疫保护作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.2由451个氨基酸残基组成。