[发明专利]一株产生抗肿瘤抗生素卡利霉素的小单孢菌C-3509

说明书

技术领域：

本发明涉及从我国土壤中筛选得到的一株产生烯二炔类抗肿瘤抗生素卡利霉素的棘孢小单孢菌蛇山变种C3509。

背景技术：

自本世纪中期以来，某些恶性肿瘤的发病率，几乎每隔十年增长一倍，已成为严重威胁人们生命的常见病、多发病。肿瘤的防治一直是医学研究的热点。自五十年代氮芥类烷化剂用于肿瘤治疗以来，化学治疗占据着不可替代的重要地位。但是，为了满足临床急需，研究人员不得不加大力度，扩展研究的深度和广度，不断开辟寻找新化疗药的途径。

微生物广泛存在于自然界，种类繁多，其代谢产物数量亦很庞大。多年来，微生物提供了各种各样生物活性物质，亦可谓是抗肿瘤抗生素的丰富资源宝库，其潜力是巨大的。自1923年φrskov建立小单孢菌属并于20世纪60年代从棘孢小单孢菌和绛红小单孢菌发酵液中分离到庆大霉素后，小单孢菌作为寻找新抗生素和其它新生物活性物质的资源愈来愈受到重视。1987年，美国科学家报导从小单孢菌中筛选到一株产生高效抗肿瘤抗生素卡利霉素(calicheamicin)的产生菌Micromonospora echinospora subsp.calichensis。2000年，美国FDA批准用于治疗复发的急性髓性白血病的Mylotarg即为单抗与卡利霉素的偶联物。卡利霉素作为弹头药物疗效已经确认，只要与不同的抗体连接，即可组成新的相关抗体药物。

本实验室在前期研究工作基础上，采用精原细胞法(“Use of murinespermatogonial assay as proscreen for antitumor drugs in proc”，13th IntCongr chemother，Viena，PP38-44；1983)，筛选出了能产生高效抗肿瘤活性物质卡利霉素的新菌种棘孢小单孢菌蛇山变种C3509(Micromonosporaechinospora var.Sheshanensis)。该变种迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。

本发明的目的是，从土壤中筛选小单孢菌菌株，对其发酵产物进行鉴定，发掘产生具有抗肿瘤作用的抗生素，以期获得具有良好开发与应用前景的抗肿瘤药物。

发明内容：

本发明提供一种能产生高效抗肿瘤抗生素卡利霉素的新的小单孢菌。其技术方案主要包括以下步骤：

1、筛选分类。取其发酵液，测紫外吸收光谱，从相似于Calicheamicin的菌株中，选取生长与发酵稳定、精原细胞活性稀释度高的C-3509菌株进行深入研究；根据菌种的形态特征、菌种的生长条件与培养特征、菌种的生理与生化特性、菌种的细胞壁化学组分及核酸碱基分析以及16S rDNA分析，进行菌种分类。

2、发酵制备，采用多级培养，其中斜面培养基主要采用Tryptone、酵母浸膏和麦芽糖；一级种子培养基主要采用糊精、Malt Extract Proteose、PeptoneYeast extract；二级种子培养基主要采用糊精、葡萄糖、Yeast extract、带鱼蛋白胨；发酵培养基主要采用葡萄糖、蔗糖、酵母浸膏粉和带鱼蛋白胨等。

3、分离纯化，发酵液离心，取样测活，收集活性部分，制成粗品，用微生物检定法、DNA断裂法测其活性，TLC测其Rf值，挑取两种检测均为高活性部分，参照Rf值进行合并，取强活性部分，反相制备柱制备，得到高效抗肿瘤活性样品。

4、结构确认，取二次薄层层析得到的高效抗肿瘤活性样品进行LC-MS检测，再取二次薄层层析得到的高效抗肿瘤活性样品进行紫外吸收检测，以确认本发明所说新种产生的活性物质与卡利霉素相似。

5、活性测定，采用DNA断裂活性测定法和细胞毒性检测法进行。DNA断裂活性测定法，是取活性物质，在紫外灯下检测pBR322 DNA拓扑结构的变化，并用Chemiimager 5500型凝胶成像系统扫描凝胶，记录结果；细胞毒性检测法，是采用MTT法测定细胞存活率。由于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，加入助溶剂二甲基亚枫(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，所以测定溶解的蓝紫色DMSO溶液在特定波长处的光吸收值，即可间接反应活细胞的数量与活性。