[发明专利]一种新型甲型流感病毒H1N1亚型双色荧光PCR检测方法及其试剂盒

说明书

一、技术领域

本试发明涉及检测新型甲型流感病毒H1N1亚型(IAV-H1N1)以及甲型流感病毒各亚型(IAV-U)mRNA的方法，特别是涉及使用双色荧光探针定量PCR技术(PCR-双色荧光探针法)快速准确的检测出样品(包括咽拭子标本、血清、分泌物及病死动物肺脏组织等标本)中新型甲型流感病毒H1N1亚型以及甲型流感病毒各亚型mRNA的方法。本发明进一步涉及用于该病毒临床检测的试剂盒。

二、背景技术

新型甲型流感病毒H1N1亚型是引起猪流感(Swine Influenza，SI)的主要病原体，该种疾病是一种急性、人畜共患呼吸道传染性疾病。1931年分离并鉴定了第一株甲型流感病毒H1N1亚型。1976年，经典的甲型流感病毒H1N1亚型首次从意大利北部猪场中分离到，这些病毒分离株与当时流行于美国的经典的猪流感有非常近的相关性。同年在美国约500人感染了甲型流感病毒H1N1亚型，该病毒与当时从猪体内分离的病毒相同，首次证实了在自然条件下，猪流感病毒可从猪传播给人。国内报道多为H1N1和H3N2导致猪流感。近年来，世界各地都有人感染猪流感病毒病不同毒株特别是H1N1亚型的报道，但并没有大规模流行。

但是2009年4月份以来墨西哥及美国等国家地区暴发了人感染甲型流感病毒的疫情。随后，该疫情迅速在世界范围内蔓延，短时间内，墨西哥、美国、加拿大、瑞士、奥地利、秘鲁、西班牙、英国、澳大利亚、韩国等国家和地区陆续有人感染甲型流感病毒疫情发生，不到一个月内，全球确诊病例和疑似累计几千例，死亡几百例，爆发之快，发展之迅速，令世人震惊和恐惧，世界卫生组织2009年4月29日将流感警戒级别上调至第五级，表明大流行迫在眉捷。对此疫情，我国卫生部和相关部门高度重视，已经采取相应应对措施，包括疫情预防控制和病原检测。全国各大疾病预防控制中心、各省级疾病预防控制中心、医院、各级出入境检验检疫局和各级动物疫病控制中心对此高度重视。

根据世界卫生组织研究证实，墨西哥和美国等地区发生的人感染猪流感病毒为新型甲型流感病毒H1N1亚型毒株，该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片断，是一种新型流感病毒。人感染后的临床早期症状与流感类似，有发烧、咳嗽、疲劳、食欲不振等，还可以出现腹泻或呕吐等症状。病情可迅速进展，突然高热、肺炎，重者可以出现呼吸衰竭、多器官损伤，导致死亡。

新型甲型流感病毒H1N1亚型属于于正粘病毒科(0rthomyxoviridae)，甲型流感病毒属(Influenza virusA)。病毒颗粒呈球状，直径为80nm～120nm，有囊膜。病毒由8个分节段的单股负链RNA组成，病毒蛋白质含有5种多肽，即血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白、核蛋白和多聚酶。

目前对于该种新型甲型流感病毒H1N1亚型以及甲型流感病毒的实验室检查主要包括以下方面：1.外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；2.血清学诊断：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等；3.逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)；3.病毒分离：从患者呼吸道标本中(咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管吸出物、痰或肺组织等)分离并培养该病毒。但是确诊依赖于从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒；RT-PCR对上述标本检测，有病毒RNA存在，并要经过测序证实。以上主要分为两类方法：免疫学检测方法和核酸检测方法。免疫学方法主要是检测血清中是否存在新型甲型流感病毒H1N1亚型病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于流感病的的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。从标本中分离猪流感病毒，进行鸡胚接种和细胞培养可能会比较敏感，但是这种方法需要2-3周的时间，操作程序上比较繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室，比如医院、疾病预防控制中心、检验检疫中心以及动物疫病控制中心推广。另有普通PCR进行新型甲型流感病毒H1N1亚型核酸检测的方法比如反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，虽然具灵敏度比上述方法略有提高，但是这种方法仅是基于用一对核酸引物进行扩增，结果容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作繁琐。