[发明专利]经紫外线诱变选育获得的高生长速率杜氏藻

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，具体而言，本发明涉及使用紫外线诱变选育杜氏藻的方法，以及由所述方法得到的一株具有高生长速率的杜氏藻诱变株ENN0001-6。

背景技术

杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)隶属于绿藻门(Chlorophyta)、真绿藻纲(Chlorophyceae)、衣藻目(Chlamydomonadales)、杜氏藻科(Dunaliellaceae)，具有单细胞、无细胞壁、基因组小等特点。杜氏藻天然没有细胞壁，是迄今为止发现的少数极端耐盐的真核生物之一。杜氏藻是杜氏藻属中一种广泛分布的单细胞海藻，只有一层由糖蛋白和神经氨酸组成薄而富有弹性的外膜包裹着原生质体。杜氏藻含有较高的β-胡萝卜素，类胡萝卜素的含量高达干重14％，而且甘油产量随外界培养液盐度升高而提高，并可作为单体蛋白及水产养殖的食物源。此外，盐藻无细胞壁，细胞灰分含量低于其他绿藻，蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素含量则较高。如正常条件下生长的绿色细胞中，蛋白质含量占细胞干重的50％～60％，碳水化合物占12％～40％，脂类占6％～10％。鉴于成为人类主要的养殖藻类之一，在商业开发中具有很高的利用价值。

紫外线在生物育种中是经常采用的物理诱变方法，特别是在微生物和植物育种中起到重要作用，随着微藻生物技术的发展和微藻附加产品的开发，紫外线在微藻筛选中也常有报道。紫外线主要对藻细胞内的酶和核酸等大分子有活化、损伤和致畸作用。有文献称紫外辐射造成的细胞损伤主要是由紫外辐射在藻体内产生的活性氧引起的。也有报道紫外线能促进单细胞藻类多糖的生物合成。

孙福征等采用紫外辐射诱导巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)突变，初步获得1株巴氏杜氏藻的突变株，突变株的β-胡萝卜素含量为原种6.2～15.5倍。黄瑞芳等采用紫外线辐射的方法对巴氏杜氏藻进行诱变，经过夏日高温(42℃～52℃)筛选，得到1株耐高温(42℃)的突变株，突变株的细胞体积是原出发株的3.0～3.4倍。但是利用紫外诱变筛选高生长率杜氏藻却少有报道。

待解决的技术问题

基于目前在世界范围内愈演愈烈的能源危机，新型生物质能源的开发利用为解决这一问题提供了新的思路。目前，在高等植物中，各种物理化学诱变方法已经被大量应用以取得具有优良性状的突变株。而在藻类中尤其是微藻中，此类研究并不多见。

紫外线对高等植物具有较强的生物学效应，能够在农业上进行诱变育种。紫外线育种具有操作简单、经济等优点。紫外线育种技术在藻类中已有大量报道，已报道紫外线在小球藻、螺旋藻等诱变育种中都起到很大作用，但在杜氏藻中报道很少，诱变后针对其生长速度的筛选研究也呈空白。本研究利用紫外线诱变杜氏藻，并以OD₇₅₀值作为衡量生长速率的指标，具有快速便捷的特点，保证了在一定数量的筛选量；而通过多步逐级筛选的方法进一步保证了微藻优良性状的稳定性，即最终获得的优良藻株是在不同规模的培养体积和容器中均有较高的生长速率。

本发明的一个目的是提供使用紫外线对杜氏藻野生株进行诱变育种的方法，及利用多步逐级筛选方法确保突变株优良性状的稳定表达，摒除在一次筛选得到突变株回复突变的可能性。

本发明的另一个目的是提供具有高生产速率的杜氏藻突变株。

发明内容

在一个方面中，本发明提供用紫外线照射诱变选育高生长速率杜氏藻的方法，所述方法包括下列步骤：

a.以杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)野生株为出发藻株，将其在培养基中在光照培养箱中进行培养；

b.将培养的杜氏藻野生藻株培养物进行紫外灯下照射诱变，无光暗培养；

c.将暗培养后的培养物置于光照培养箱中正常培养；

d.将按步骤c培养后的藻液测定OD值，稀释到一定浓度涂布固体培养基平板；

e.待上述固体平板上生长出单藻落，挑取较大的生长迅速的单藻落于新的固体培养基平板上保存；

f.高生长速率的藻株的初筛；

g.高生长速率的藻株的复筛。

在一个实施方案中，所用的杜氏藻野生株为UTEX LB 999。

在一个实施方案中，所用培养杜氏藻的Erdschreiber’s Medium(简称EM)培养基。

在一个实施方案中，进行紫外诱变的杜氏藻出发藻株培养物处于对数生长期。

在一个实施方案中，所述正常培养条件为25℃，4000lux，12h L/12h D。

在一个实施方案中，所述紫外诱变采用2个20W紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离30cm，照射75s。