[发明专利]一种低分子量EC-SOD重组酶及其制备方法及其用途

权利要求书

1.一种低分子量EC-SOD重组酶，其特征在于，包括EC-SOD活 性中心和C-端结构域，核苷酸序列为SEQ ID NO：1所述。

2.一种如权利要求1所述低分子量EC-SOD重组酶基因的制备方 法：包括下列步骤：

(一)全基因的获得

(1).引物设计

Primer I 5’GGAATTCCATATGTCCAGCCGCGCC-3’其中划线部 分为NdeI的酶切位点；

Primer III 5’-CACGCCCACCACGCCGCAGGCCAG-3’其中划线部 分为Cys---Gly的突变位点；

Primer II 5’-ATTGGATCCTTAGGCGGCCTTCTTCTCGCTC-3’ 其中划单线部分为BamHI的酶切位点，划双线部分为Cys---Lys的突变 位点；

PrimerIV5’-GTGGTGGGCGTGTCCGGGCCCGG-3’其中划线部 分为195Cys---Ser的突变位点；

(2).片段A的制备

以EC-SOD基因、GenBank NCBI，GI：6649为模板，利用引物 Primer I和Primer III钓取片断A，扩增条件为：94℃变性1min，50 ℃退火30sec，72℃延伸1min，循环30次；

(3).片段B的制备

以EC-SOD基因为模板，利用引物PrimerII和PrimerIV钓取片断 B，扩增条件为：94℃变性1min，50℃退火30sec，72℃延伸1min，循 环30次；

(4).制备全长重组EC-SOD基因

将前面所获得大片段A和小片段B分别稀释150倍和200倍，用 作PCR的模板，利用引物Primer I和PrimerII进行PCR反应得到全 长的重组EC-SOD基因；

(二)重组质粒的构建，转化

(1)重组酶的全长基因经用NdeI和BamHI双酶切后，酶切产物 经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒回收目的基因，溶 于10μl的TE中；

(2)提取质粒pET-28a(+)，经进一步纯化后，产物用BamHI和 NdeI双酶切，经纯化后，溶于30μl的TE中；

(3)目的基因与pET-28a(+)连接，连接产物转化至E.coli BL21 DE3中，涂布于含有100μg/ml AmpicillinLB平板上，37℃培养过夜；

(4)次日，挑取单菌落，接种于3ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB 培养基中，37℃培养过夜；提质粒，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测其大小； 选取大于pET-28a(+)的重组质粒，并以BamHI和NdeI双酶切鉴定，电 泳检测；

(5)挑取阳性克隆菌落，接种于1L含有50μg/ml氨苄青霉素的 LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，每升菌液中加入浓度为0.8M IPTG 500μl，0.3mol/L CuSO₄和0.03mol/L ZnSO₄100μl，37℃，170rpm， 诱导表达四个小时后，收集菌体；

(6)将诱导后的菌体破碎后，经Ni柱层析，肝素亲和层析和离 子交换层析纯化。

3.一种如权利要求1所述低分子量EC-SOD重组酶基因的制备 方法，其特征在于：目的基因与pET-28a(+)连接，连接产物还转化入 酵母细胞或真核细胞中并获得表达。

4.如权利要求1所述的低分子量EC-SOD重组酶在制备清除自 由基的药物中的应用。