[发明专利]作为重组蛋白和酶技术的工具的SlpA

说明书

本发明涉及含有SlpA分子伴侣和靶多肽的融合蛋白；重组表达、纯化和重折叠这些融合蛋白的方法；它们在蛋白和酶生物技术中的用途，尤其是它们在诊断中的应用。此外，本发明涉及含有SlpA和靶多肽的任何复合物，所述复合物旨在增加用于生物技术应用的靶多肽或酶的溶解性、活性、稳定性和/或折叠可逆性。

发明背景

蛋白折叠是一个自发的过程，该过程由天然状态和未折叠状态之间的Gibbs自由能的微小差异驱动。在折叠过程中，基本上未结构化的多肽链采用所谓的蛋白的天然构象或三维结构。不完全折叠的分子的聚集与生产性折叠竞争，这成了一个严重问题，这种竞争在体内和体外均影响折叠收率。在活细胞中，折叠由辅助蛋白帮助。折叠辅助物为辅助其它蛋白折叠并维持其结构完整性的多肽。它们可逆地与其靶相互作用，由此防止有害的副反应，例如聚集过程，从而具有促进多肽链正确折叠的能力。它们在体内和体外均有此能力，这些折叠辅助物在生物技术问题中的应用数量一直在增加。一般而言，折叠辅助物被细分为折叠催化剂和分子伴侣。

分子伴侣已知与多肽的变性的、部分变性的或简单地说疏水表面可逆地结合，并由此帮助复性蛋白或使它们保持在溶液中。分子伴侣通过可逆地结合和遮蔽疏水表面降低有聚集倾向的折叠中间体和有聚集倾向的折叠蛋白的浓度。它们因此只发挥结合功能。相反，折叠催化剂如二硫化物氧化还原酶和肽基脯氨酰顺/反异构酶加速蛋白折叠的限速步骤，由此缩短折叠中间体的寿命。折叠催化剂因其催化功能而降低有聚集倾向的折叠中间体的浓度。一类重要的折叠催化剂被称为肽基脯氨酰顺/反异构酶(PPI酶)。

基于序列相似性、蛋白拓扑学和免疫抑制分子的结合，脯氨酰异构酶被分成3个不同的家族：环孢素、小小菌素(parvulins)和FK506结合蛋白(因此首字母简略词为FKBP)。FKBP结合已用作免疫抑制药物的FK506、雷帕霉素和相关大环内酯衍生物，并被它们抑制。

在大肠杆菌(E.coli)中属于肽基脯氨酰顺/反异构酶的FKBP家族的推定折叠辅助物为SlpA，SlpA是“SlyD-样蛋白A”的首字母简略词(Hottenrott等，1997，JBC 272/25，15697-15701)。一直到现在还缺乏有关SlpA及其在大肠杆菌中的生理作用的信息。尽管已报道了SlpA的脯氨酰异构酶活性较差，但该蛋白迄今仍相当神秘。迄今为止，还没有有关SlpA的物理-化学特性或可能的分子伴侣特性的信息，甚至还没有提到SlpA在大肠杆菌胞质中的功能。

在许多诊断应用中，重组产生的蛋白用作结合配偶体，例如在设计用于检测特异性免疫球蛋白分析物的免疫测定中用作抗原。这些抗原可以作为融合蛋白含有的一部分生产，其构成目标部分或抗原性多肽，旨在识别和结合在所研究的样品或测定混合物中存在的特定部分。重组产生的融合蛋白的另一部分为多肽部分，该部分融合至赋予特异性的抗原性部分，以利于其克隆、表达、过度生产、折叠/重折叠和纯化，并利于增加其溶解性、其稳定性或其折叠可逆性。重组产生的融合蛋白的合成在先有技术中已充分描述。还已充分确认的是，使用分子伴侣作为融合蛋白的组成部分是有利的，该部分起辅助分子的作用，用于靶多肽的表达、折叠、纯化、溶解和增加整体稳定性。

美国专利号6,207,420公开了用于表达蛋白的融合蛋白系统，其中靶多肽部分的氨基酸序列和融合肽部分来源于不同生物。最近，可以表明FkpA和SlyD适合作为生产重组蛋白的融合组件。两个分子伴侣均增加其客户蛋白在原核宿主中的表达率，支持正确的重折叠，并增加甚至有极度聚集倾向的蛋白(如逆转录病毒跨膜蛋白)的整体溶解性(Scholz等，2005，JMB 345，1229-1241和WO 03/000877)。

尽管FkpA和SlyD尤其适用于帮助有难度的或有聚集倾向的蛋白在诊断试剂(更一般地讲，生物技术应用)中采取和保持其天然结构，但仍存在热稳定性的难题。蛋白的天然构象通过范德华接触、氢键、盐桥和疏水作用的细致平衡的网络来稳定。优化这些接触成为相应蛋白的微环境，pH、离子强度或温度的改变确实扰动折叠和去折叠分子之间的平衡。温度的增加尤其适合于变性蛋白，其常常导致完全或部分去折叠的分子聚集。热诱导的蛋白聚集和伴随的功能丧失对任何蛋白制品都构成严重问题。完全可以想到的是，在蛋白试剂或制品的不恰当装运或储存过程中可能发生温度升高，或者更一般地讲，可能发生热应激。