[发明专利]基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型H1N1流感病毒基因

说明书

发明领域

本发明是用基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型H1N1流感病毒HA基因。用于各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院对人甲型H1N1流感病毒的检测和监测。

发明背景

甲型H1N1流感(原称人感染猪流感病毒)是一种新的甲型H1N1病毒引起的急性呼吸道传染病，具有较强的传染性，可通过近距离飞沫和接触传播，这种新型病毒是美国于2009年4月在人体中首次检出的。目前，甲型H1N1流感疫情已在全球较大范围内传播，世界卫生组织已将流感大流行预警级别提至5级。截止2009年5月21日，世界卫生组织共接到41个国家累计报告甲型H1N1流感确诊病例11034例，死亡85人。我国内地累计报告甲型H1N1流感确诊病例5例(北京2例，四川、山东、广东各1例)，均为输入性病例。鉴于我国已出现输入型甲型H1N1流感病例，为有效阻止疫情的传入和发生疫情后的应急处置，根据卫生部应对甲型H1N1流感疫情防控要求，我国已决定在各地增加病毒检测实验室和哨点医院，扩大监测网络的覆盖范围。将网络实验室扩大到整个地市一级，目标是使全国300多个地市都具备能够进行病毒检测的能力，及早发现可能出现的输入性病例和内地人传人病例，切实做到早发现、早报告、早处置。本专利成功建立的基于颜色的RT-LAMP检测人甲型H1N1流感病毒基因方法，将为提高我国流感监测网络实验室和哨点医院的监测能力，实现对发热病人的快速筛查提供了有力的技术保障。

基于颜色的RT-LAMP技术在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方法无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，它的检测时间可以缩短到两小时以内，灵敏度可达到检测十个拷贝以上的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反应在65℃等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会。第三，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第四，RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁白色沉淀，HNB染料在扩增前加入，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物和反应管内颜色的变化，可以直接判定检测结果。

发明内容：

1.本发明是对目前对RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。第三，所有的扩增过程都可在65℃同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间。

2.选择人甲型H1N1流感HA基因的756-956位的相对保守区设计相应的RT-LAMP引物，其中包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(Loop1、Loop2)。所有引物的具体序列见表1。

表1：RT-LAMP检测人甲型H1N1流感HA基因的引物序列