[发明专利]一种体外热原的测定方法

权利要求书

1、一种体外热原的测定方法，其特征是利用人静脉血液和待检样品充分接触反应，反应后混合液体经离心得无细胞上清液，再用Elisa法检测无细胞上清液中细胞因子IL-1β的含量；在相同反应条件下，通过人静脉血和已知不同浓度的LPS充分混合反应，绘制标准曲线来定量待检样品所携带的热原物质。

2、根据权利要1所述的体外热原的测定方法，其特征是按如下步骤操作：

a、采血：采集健康者静脉血液，将所采集的静脉血液用肝素、乙二胺四乙酸盐或枸橼酸盐进行抗凝获得抗凝血液作为备用血样；所述静脉血液是来自于单个健康体，或来自于多个健康体的混合血液，所述混合血液之间血型相同、交叉配血试验红细胞无凝集反应；

b、将待检样品放置到反应容器中，向反应容器中分别加入RPMI 1640溶液和备用血样；按体积比的备用血样：RPMI 1640溶液的比值A为1∶1～100；

c、设置多个与反应容器相同类型的并联容器，在所述并联容器中分别加入用RPMI 1640溶液稀释成不同浓度的脂多糖LPS溶液，所述不同浓度的脂多糖LPS溶液，其最低浓度为0pg/ml，最高浓度为100pg/ml，最低浓度和最高浓度之间设立3～8个脂多糖LPS浓度组，在所述并联容器中分别加入备用血样；所述加入在各并联容器中的备用血样与脂多糖LPS溶液的体积比为比值B；所述比值B与步骤b中的比值A相等；所述反应容器和并联容器均为PVC膜制品，其膜表面呈微凸凹的刨砂状；

d、封闭所述反应容器和各并联容器，于37℃、体积浓度为5％的CO₂的环境中温育24小时后，离心2分钟，随即取出所述反应容器和各并联容器中的无细胞上清液，对所述无细胞上清液直接通过Elisa试剂盒测定人IL-1β的含量或保存于-80℃环境中待测；

e、以各并联容器中所测得的人IL-1β的含量为纵坐标，各人IL-1β含量对应的不同浓度脂多糖LPS溶液为横坐标绘制标准曲线；再在所述标准曲线上标定出以所述反应容器中的人IL-1β的含量测定值为纵坐标的测定点，所述标准曲线上测定点的横坐标值即为待检样品的热原含量。

3、根据权利要求2所述的体外热原的测定方法，其特征是所述步骤a中备用血样的制备为：

a、按如下过程冻存血液

将所述抗凝血液在冰水中预冷15分钟后，在不断轻摇中向抗凝血液中添加二甲基亚砜得混合液，所述混合液中的二甲基亚砜的终浓度按体积比为10％～15％；移取所述混合液至经冰水预冷的冷冻管中，将所述冷冻管置于冷冻室内，以1℃/分钟降温至-5℃得冷冻液，继续降温使冷冻液达到结晶温度-12℃，再将冷冻液以2℃/分钟降温至-40℃，在-40℃的状态下放置120秒，再将冷冻液以10℃/分钟的速度降至-120℃完成冷冻，盛有冷冻液的冷冻管储存于液氮中；

b、将储存于液氮中的冷冻管内冷冻液以37℃～40℃解冻为液态得备用血样。