[发明专利]一种快速检测黄曲霉毒素含量的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种微生物含量的测定方法，确切地说是一种农副产品中黄曲霉毒素含量的快速测定方法。

二、背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin)是常见曲霉菌黄曲霉(AspergiUusflavus)和寄生曲(A.parasiticus)中产毒菌株的代谢产物。主要毒素是B1、B2、G1和G2，其中B1是毒性和危害最大的一种。黄曲霉毒素是目前所知致癌性最强的化合物，广泛存在于花生、花生油、大米、玉米、糕点等粮油食品和动物饲料中，严重影响人们的健康，甚至威胁着人们的生命安全。

我国是世界上的花生主产和出口国之一，国内的一些花生进出口企业，往往由于报检通关手续繁杂，造成成品花生在仓库积压，而在花生贮藏过程中往往由于管理不善或者天气等原因，易受到微生物污染造成质量严重下降。国外有些国家对于花生等农产品的检测标准也趋见苛刻。目前，为满足出入境检验检疫的需要，各国采取的检测黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫亲和柱净化荧光光度法、免疫亲和柱净化高效液相色谱法、多功能柱色谱净化高效液相色谱法等，这些方法一般操作比较复杂、检测时间长、检测结果不够精确。而更为快速精确的液相-串联质谱联用检测法(LC-MS/MS)却鲜有报道，本研究就利用LC-MS/MS法检测花生样品中的黄曲霉毒素含量。

三、发明内容

本发明旨在提供一种快速测定农副产品中黄曲霉毒素含量的方法。所要解决的技术问题是建立高效液相色谱和质谱串联使用系统(LC-MS/MS)。

本发明的技术方案首先将原料(农副产品)粉碎，然后萃取、过滤，滤液经纯化后进行检测，以花生为例，具体过程如下：

1、取50g粉碎后过筛样品和5g氯化钠转移到干净的均质器中，加入100ml 80％甲醇水溶液(80∶20)高速均质1min。将其过滤，至少留滤液10ml，用20ml去离子水稀释5ml萃取液并彻底混合，再用玻璃纤维滤纸过滤，取滤液。

2、将10ml无菌注射器接于免疫亲和柱上部，取10ml已稀释的萃取液以1-2滴/S的速度通过免疫亲和柱，再用2ml去离子水洗柱，最后用1ml甲醇洗脱并将洗脱液收集于干净的比色皿或其他容器中待用。

3、色谱条件的选择

色谱柱：Waters Symmetry C18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流动相A：10mM乙酸水溶液；流动相B：100％甲醇；柱温40℃；流速0.2～1ml/min；梯度程序：B在0min为50％，在0～10min增至90％，在10～15min从90％降低为50％。

4、质谱条件的优化

本研究离子化模式采用电喷雾(ESI)正离子模式，通过全离子扫描(Full scan)确定AFB₁、AFB₂的选择离子，丰度最高的碎片是含Na离子的化合物：AFB₁对应335.2m/z、AFB₂对应337.2m/z、。对质谱条件进行优化：气帘气(CUR)10～30ml/min、离子化电压(IS)4500V、雾化气(GS1)10～30ml/min、辅助雾化气(GS2)30～40ml/min、辅助加热器温度(TEM)450℃。

本方法对5份脱皮花生仁样品进行了黄曲霉毒素含量检测，结果见表1。

Table1 LC-MS/MS测脱皮花生仁样品中黄曲霉毒素含量结果

本方法提取和净化过程使用的是甲醇，减少了对试验人员的伤害，同时检测花生中的黄曲霉毒素B1、B2，检测限分别为0.15μg/kg、0.09μg/kg回收率为84.3％～107.5％，相对标准偏差为5.3％～9.7％。本发明具有简便、快捷、精密、准确的特点，为农副产品中黄曲霉毒素含量检测提供方便可靠的检测手段。

四、附图说明

图1是黄曲霉毒素B₁、B₂总的离子流色谱图，在20min内出峰顺序为AFB₂、AFB₁，分离效果好。

图2是黄曲霉毒素B₁、B₂的选择离子(SIM)色谱图。就是选择离子(SIM)条件下的色谱图

图3是LC-MS/MS测黄曲霉毒素B₁标准曲线。

图4是LC-MS/MS测黄曲霉毒素B₂标准曲线。

五、具体实施方式

现以花生为例，非限定实施例叙述如下：