[发明专利]一种L-丙氨酸的微生物发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及L-丙氨酸的生产方法，具体涉及一种L-丙氨酸的微生物发酵生产方法。

背景技术

L-丙氨酸在医药、食品、化工等行业有着十分广泛的用途。L-丙氨酸在医药上用途是V_B6的重要原料，是营养增补剂(补糖氨基酸营养输液)的组成部分。由L-丙氨酸组成的复合氨基酸注射液-14氨基酸注射液-800是主治肝脑病新药，可治疗肝功能不全时氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒，同时L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。例如生产L-氨基丙醇、V_B6、S-2-氯乙酸、安尿通等。

L-丙氨酸一般是利用假单胞菌作为生物催化剂采用固定化或细胞悬液酶解L-天门冬氨酸生产，收率大于90％。

国内现有宁波科瑞生物工程公司、北京怡康盛达生物技术有限公司、安徽省科苑(集团)股份有限公司等多家公司均生产L-丙氨酸产品，产品有食品级和工业级，生产的方法大都是利用假单胞菌产生的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，将L-天冬氨酸转化成L-丙氨酸。南京工业大学(南京化工大学)开展L-丙氨酸酶法合成的研究较早，利用假单胞菌获得高活性的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以L-天冬氨酸为底物，采用游离细胞法转化生产L-丙氨酸，平均收率为90％，产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准；并拥有酶法生产L-丙氨酸的发明专利，该技术可生产得到光学纯度的L-丙氨酸；同时成立了国家生化工程技术中心，中心拥有年产1000吨L-丙氨酸的生产技术。大连轻工业学院对中空纤维膜反应器，利用假单胞菌转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，转化率超过90％。中国药科大学也对L-丙氨酸酶法生产技术进行了研究，采用循环式生物反应器，利用固定化德阿昆合假单胞菌体的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。

丙氨酸是细胞蛋白质必不可少的组成成分，多数微生物使用葡萄糖丙酮酸转移酶来合成丙氨酸(Hashimoto and Katsumata，1998)，一些生物体如节杆菌(Hashimoto and Katsumata，1993，1998；1999)、球形芽孢杆菌(Ohashima andSoda，1979)、梭状芽孢杆菌(Orlygssony等，1995)使用NADH-脱氢酶从丙酮酸和氨基酸来生产丙氨酸。

质粒转移基因编码NADH-脱氢酶作为实验手段用于促进合成得到不同程度的成功。基因工程菌株发酵单胞菌mobolis CP4在5％葡萄糖厌氧发酵表达了低水平生产消旋丙氨酸的能力(Uhlenbusch等，1991)。一株ldh-标记的含有丙氨酸消旋酶突变基因工程乳酸菌在相似方法下发酵1.8％葡萄糖产生12.6g/l L-丙氨酸(Hols等，1999)。一株双突变大肠杆菌发酵通过好氧和厌氧2个阶段24小时发酵产生32g/l丙氨酸浓度(Lee等，2004)。随着进一步的筛帅选和过程优化，消旋丙氨酸浓度在更加复杂的反应体系达到88g/l，接近了理论最大值(Smith等，2006)。但是，这种菌株志产生一种消旋丙氨酸，利用多类型质粒需要抗生素的选育，并且需要复杂的介质复杂的多阶段发酵过程(Smith等，2006)。

已有的文献及专利有如下报道：

1、L-丙氨酸酶法工业生产的研究

在800升气升式发酵罐上配有假单胞菌Pse.NX-1，获得高L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活。以L-天冬氨酸为底物游离细胞法转化生产L-丙氨酸，每升培养液可转化L-天冬氨酸2kg，最高达2.5kg，提取得到L-丙氨酸1.2kg，平均收率90％，产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准。(《工业微生物》1997，27(2)，17-20页)；

2、利用假单胞菌天冬氨酸-β-脱羧酶高效生产L-丙氨酸

通过右边筛选得到一株具有高活性L-Asp-β-脱羧酶的菌株PseudomonasNX-1，对该株酶形成和酶反应的条件进行了详细的研究，该株可以高效地转化L-Asp生成L-Ala，转化4-5d，每L培养液可转化L-Asp量高达1400g左右，生成L-Ala浓度高达90％以上，摩尔转化率近100％。(《南京化工学院学报》1995，17(1)，1-6页)；