[发明专利]一种可溶表达的流感病毒血凝素HA2融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种流感病毒的血凝素HA2片段的蛋白表达方法，该表达方法可在真核细胞如HEK-293系统中获得可溶性的表达。

背景技术

流感是由流感病毒引起的可致人感冒，发烧，咽喉肿痛，咳嗽的一种病症。其中最具有高致命性的是禽流感的H5和H7亚型。从流感康复病人身上获得的抗血清一直是流感病人的一种重要的治疗方式。但由于流感的类型多，每年的变异又很大，抗血清对新的突变株的结合效果很差，这使得流感的针对性治疗无法有效进行。对流感康复病人的抗血清分析发现，绝大部分的抗血清主要针对血凝素蛋白(hemagglutinin，简称HA)。凝集素蛋白是流感病毒的受体结合和膜融合糖蛋白，也是感染-中和抗体的结合靶标【Laver WG等，Virology 1976，69(2)：511-522】。它使得病毒与宿主细胞表面含唾液酸(sialic acid)的受体贴附，并发生低pH诱导的构象转变，引发病毒外壳与内体膜融合。该构象转变的过程为蛋白酶将血凝素的前体蛋白HA0切割为两个二硫键连接的HA1和HA2蛋白(lazarowitz.S.等，1975，Virology，68：440-454)。HA2亚基的N端有一段高度疏水的区域，该区域在不同类型的流感病毒株中都高度保守，并且参与病毒与宿主受体细胞膜的融合活性(Lamb.R.A等，1983，Springer-Verlag，Berlin.21-69)。该区域发生突变，病毒的融合活性会丧失或很大程度降低(Mary-Jane.G.等，TheJournal of Cell Biology，1986，102：11-23)。

近来有实验室用康复病人的血液的B细胞建立了抗体文库，通过大量的筛选找到了针对HA2区域的较广谱的中和抗体【Damian C.E.等，Science2009，324(5924)，246-251；Tkacova，M.等，1997，J Clin Microbiol 35，1196-1198】，这些抗体可与HA2的融合肽或其附近结合，抑制HA与细胞膜的融合功能【E.Varekov等，2003，Arch Virol 148，469-486】。这个重要的发现使获得广谱的中和抗体成为了可能。因此科学家都将目光投入到针对HA2融合肽的抗体研究和具有交叉保护的抗流感病毒的疫苗研究工作中。

HA蛋白为三聚体结构，分析其晶体结构发现其表面裸露的大部分蛋白都为HA1的部分，而HA2蛋白由于其所含的疏水性蛋白较多，它位于蛋白的内部。HA1蛋白在季节性流感和禽流感等流感亚型病毒中的变异较大，但HA2蛋白却相对保守。

亚单位疫苗血凝素蛋白(hemagglutinin，简称HA)是一个很有吸引力的流感病毒灭活疫苗的替代品，HA蛋白疫苗的制备过程比灭活疫苗更安全，简单【Treanor JJ等，Vaccine，2001，19(13-14)：1732-17370】，它不会产生针对流感病毒内部蛋白的抗体，这可用于区分接种和受感染的禽类。由于其保守性和功能性，HA2蛋白亚单位流感疫苗的一个很好的选择有可能使人体产生具有广谱和交叉保护的中和抗体，从而避免经典流感灭活疫苗每年需要接种的不利因素，更重要的是，可以使接种人群对未来不可预测的突发性新型流感病毒感染具有免疫保护抗体。HA2蛋白还可以用于免疫动物或用于从全人抗体库中筛选获得针对HA2保守区域的具有交叉保护作用的治疗性中和抗体。

重组蛋白可以在多个真核细胞表达体系中进行表达生产，也可以采用微生物表达体系进行表达生产。对于结构比较简单，蛋白翻译后修饰很少或翻译后修饰对蛋白结构和活性没有影响的蛋白，可以直接采用微生物表达体系，如大肠杆菌表达体系进行表达生产。对于结构相对比较复杂，蛋白翻译后修饰很重要的蛋白通常很难采用微生物表达体系获得，而需要采用真核细胞表达系统进行表达生产。真核细胞表达体系包括哺乳动物细胞，酵母细胞，和昆虫细胞/杆状病毒表达体系。

常用的哺乳动物细胞表达体系包括瞬时表达体系和稳定表达体系，瞬时表达体系可以采用人HEK293细胞，或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等，其主要方法是将大量的表达载体DNA质粒通过转染试剂进入细胞内进行短时间内的蛋白表达，大部分DNA质粒并未整合到细胞的染色体上，因而不能实现长期的稳定表达。稳定表达体系是通过筛选DNA质粒整合到细胞染色体上的稳定表达克隆并建立稳定表达细胞株进行培养表达。常用的稳定表达宿主细胞系有人HEK293细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，BHK细胞，SP2/0细胞等。