[发明专利]临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和储存

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)无菌条件下取正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，用含2％庆大霉素的生理盐水反复冲洗，去除残留血迹；

(2)将脐带置于含2％庆大霉素的生理盐水中，用无菌剪刀将其剪切至约颗粒状，组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟；

(3)将步骤2所获的组织块用含10％胎牛血清的DMEM培养基悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟；

(4)将步骤3获得的组织块沉淀均匀种植于塑料细胞培养瓶中，置于5％CO₂培养箱中，待组织块完全贴壁后，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基；

(5)于培养第10天在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中继续培养1周；

(6)待细胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3传代；

(7)经14～15天扩增后，细胞传至4～5代，得到间充质干细胞。

2.权利要求1的制备方法，其特征在于，所述步骤进一步包括，将步骤7获得的间充质干细胞进行病原生物检测，同时进行细胞表型检测，合格后加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃，记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期，即得合格的间充质干细胞。

3、权利要求1的制备方法，其特征在于，操作均在严格无菌条件下进行，使用的细胞培养基中加入0.2％的庆大霉素。

4、权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)无菌条件下取正常顺产的胎儿脐带，脐带长约20cm，用含2％庆大霉素的生理盐水反复冲洗，去除残留血迹，同时进行病原微生物检测，完全合格后，进行以下步骤，

2)将脐带置于含2％庆大霉素的生理盐水中，用无菌剪刀将其剪切至颗粒状，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，

3)将步骤2所获的组织块用含10％胎牛血清的DMEM培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，去除大量组织块黏液，

4)将步骤3获得的组织块沉淀均匀种植于塑料塑料细胞培养瓶中，置于5％CO₂培养箱中，待组织块完全贴壁后，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，

5)于培养第10天在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞，将组织块全部吸出，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中继续培养，

6)1周后待细胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3传代，

7)经15天扩增后，细胞传至5代，获得1×10⁸MSCs，

8)将步骤7扩增后获得进行病原生物检测，同时进行细胞表型检测，合格后加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃，记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期。

5、权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)无菌条件下取剖腹产的胎儿脐带，脐带长约25cm，用含2％庆大霉素的生理盐水反复冲洗，去除残留血迹，同时进行病原微生物检测，完全合格后，进行以下步骤，

2)将脐带置于含2％庆大霉素的生理盐水中，用无菌剪刀将其剪切至颗粒状，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含2％庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，

3)将步骤2所获的组织块用含10％胎牛血清的DMEM培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，去除大量组织块黏液，

4)将步骤3获得的组织块沉淀均匀种植于塑料细胞培养瓶中，置于5％CO₂培养箱中，待组织块完全贴壁后，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，

5)于培养第10天在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞，将组织块全部吸出，补加含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于5％CO₂培养箱中继续培养，

6)1周后待细胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3传代，

7)经传至15代，获得4×10⁹MSCs，

8)将步骤7扩增后获得进行病原生物检测，同时进行细胞表型检测，合格后加入冻存液后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃，记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期。