[发明专利]一种丹参异戊烯焦磷酸异构酶(SmIPPI)基因的分析及应用

说明书

技术领域

本发明属于药用植物基因工程领域，具体地说，涉及利用cDNA芯片技术克隆一种新的丹参异戊烯焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase，IPPI)基因，转化该基因以提高丹参中二萜类次生代谢产物含量的方法。

背景技术

药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将破解药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

萜类(terpene)是植物界广泛存在的一类天然烃类化合物，具有异戊二烯(isoprene)单元组成的基本骨架，根据所含异戊二烯数目的不同，萜类可分为单萜、倍半萜、二萜、三萜等。许多二萜类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，药用植物中很多活性成分如紫杉醇、丹参酮II A、雷公藤甲、乙素等均为二萜类化合物。药用植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为一味常用中药，素有“一味丹参，功同四物”的美称，具有活血化瘀，理气止痛的功效，是众多复方、保健品的主要成分。丹参中主要含有两类活性成分：脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物。

萜类化合物生物合成途径亦称为类异戊二烯生物合成途径(isoprenoid biosynthesispathway)，由甲羟戊酸途径(MVA)和丙酮酸、磷酸甘油醛途径(MEP)组成。MVA途径存在于细胞质和线粒体，主要为甾醇、特定的倍半萜和泛醌等提供前体物质；MEP途径位于质体，主要为半萜、单萜、二萜和多萜等提供前体物质。IPPI正是处于MVA和MEP途径的交汇位置，其功能是催化异戊烯焦磷酸酯(IPP)和甲基丙稀基焦磷酸酯(DMAPP)之间的同分异构化。随后，IPP和DMAPP之间，以及IPP和DMAPP缩合产生的中间产物间，可以发生多次聚合反应，最终合成出各种各样的类异戊二烯类物质。

异戊烯焦磷酸异构酶基因的表达水平直接影响萜类合成五碳前体库的代谢流流向，是下游代谢途径的总开关(2000)。Kajiwara认为(1997)，植物体内的异戊烯焦磷酸异构酶可能是一关键性的限速酶，他们将酵母(pharfi arhosozyma)和雨生红球藻中分离的IPPI cDNA转入大肠杆菌菌株JM101后番茄红素产量增加3.6-4.5倍。Sun等(1998)在单细胞绿藻中导入外源IPPI基因，导致细胞中类胡萝卜素大量累积，并且含量与IPPI基因的表达量正相关。因此，IPPI基因在萜类物质生物合成中是一个重要的调节因子，它的超量表达，利于代谢流向下游流动，将促进下游相关产物的生物合成。

植物中的IPPI，最早是1996年Blanc，V.M.等在伯惠绣衣(Clarkia breweri)中克隆到，而真正有功能的IPPI是1998年Campbell等在拟南芥中克隆到的。随后在很多物种中都克隆到IPPI基因，如橡胶树(Hevea brasiliensis)，烟草(Nicotiana tabacum)，玉米(Zea mays)等。本发明首次从药用植物丹参中克隆到了丹参Sm IPPI基因片段，采用RACE技术克隆得到其cDNA的全长序列，并对其进行功能鉴定及转基因操作。本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的丹参异戊烯基转移酶基因及其氨基酸序列。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丹参cDNA芯片的制作、杂交、差异基因分析以及功能基因克隆的方法，并提供一种过表达IPPI基因以提高丹参中萜类成分含量的方法。本发明涉及的丹参cDNA芯片克隆关键酶基因、IPTG诱导大肠杆菌原核表达、载体构建、遗传转化、分子检测、丹参酮类成分提取及含量测定方法用于本发明，为利用转基因丹参大规模生产有效成分奠定了坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明应用cDNA基因芯片方法从丹参中克隆IPPI基因，检测茉莉酸甲酯处理后SmIPPI基因的表达情况及丹参酮II A含量的变化情况；构建含所述DNA分子的大肠杆菌原核表达载体，IPTG诱导原核表达；构建含所述DNA分子的植物过表达载体，用根癌农杆菌介导，将IPPI基因导入丹参并再生出植株；PCR检测外源目的基因IPPI的整合情况，HPLC测定丹参中二萜类成分含量，筛选获得二萜类成分含量显著提高的转基因丹参植株。

本发明包括如下具体步骤：