[发明专利]丹参4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因及其编码的蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明涉及利用PCR技术克隆植物二萜途径生物合成基因及其编码产物与应用，尤其涉及丹参主要活性成分丹参酮类化合物生物合成的4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点(魏小勇，方花，李杰芬.植物中药功能基因研究.中草药，2005，36(8)：1251-1254)，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.根中所含的脂溶性活性成分主要为二萜醌类化合物(丹参酮类)。在高等植物中，萜类成分的生物合成至少通过两条途径，一条是甲羟戊酸(MVA)途径，另外一条是非甲羟戊酸(DXP)途径(Lichtenthaler HK.Non-mevalonateisoprenoid biosynthesis：enzymes，genes and inhibitors.Biochem Soc Trans，2000，28：785-789；Laule O，Furholz A，Chang HS，et al.Crosstalk between cytosolic and plastidial pathways ofisoprenoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100：6866-6871)。据报道，丹参酮类成分(二萜类)的生物合成主要通过DXP途径(Ge XC，Wu JY.Tanshinoneproduction and isoprenoid pathways in Salvia miltiorrhiza hairy roots induced by Ag⁺ and yeastelicitor.Plant Sci，2005，168：487-491；Chen H，Chen F，Chiu FCK，et al.The effect of yeast elicitoron the growth and secondary metabolism of hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza.EnzymeMicrob Technol，2001，28：100-105)。其中4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK)为DXP次生代谢途径上的唯一激酶，目前对于该酶编码基因研究报道很少，仅见拟南芥、水稻、薄荷、胡黄连和番茄等有登录(GenBank)。Rohdich报道了一个来源于番茄的预测蛋白，推测其催化功能域(81-401氨基酸残基)与大肠杆菌的CMK有同源性，可能是番茄中的CMK，该催化功能域在大肠杆菌中得以表达纯化，通过放射性标记前体饲喂，证明该催化功能域能够将4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)磷酸化生成4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸(CDP-MEP)(Rohdich F，Wungsintaweekul J，Eisenreich W，etal.Biosynthesis of terpenoids：4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol synthase of Arabidopsisthaliana[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97：6451-6456)。本发明在前期利用基因芯片技术克隆得到丹参SmCMK的基因的基础上(王学勇，崔光红，黄璐琦，高伟，袁媛.丹参4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶的cDNA全长克隆及其诱导表达分析.药学学报，2008，43(12)：2-8)，进一步对其进行转基因操作，结果表明过表达SmCMK能显著提高丹参毛状根中丹参酮类成分含量。本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的丹参4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的转基因操作和对丹参次生代谢产物积累的影响。

发明内容