[发明专利]快速连续检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法

说明书

技术领域

本发明属于在线检测粪大肠菌群及大肠杆菌的方法领域，尤其是快速连续检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法。

背景技术

大肠菌群作为水质粪便污染指示菌的原因及概念：

总大肠菌群系指一群在37℃培养24～48小时能发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。总大肠菌群可作为粪便污染的指示菌。但是水中总大肠菌群不只来自人和温血动物的粪便污染，还能来自植物和土壤的天然存在。仅来源于人和温血动物粪便的大肠菌群称粪大肠菌群，是可在44.5℃培养温度下生长的耐热大肠菌群。由于大肠菌群是人及各种动物肠道中的正常寄居菌，常随粪便从人及动物体排出广泛散播于自然环境中。所以一旦检出，即意味着直接或间接地被粪便污染。在卫生学上大肠菌群被用作饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标。大肠菌群在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近，它的出现也可能预示着某些肠道病原菌例如沙门氏菌、志贺氏菌的存在，因此它是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在制定标准时，将大肠菌群作为微生物污染状况的监测指标和实施效果的评估指标。

目前的检测方法速度慢，不利于推广和实际应用。

发明内容

本发明公开了一种远远快于常规检测，有利于实际推广和应用，能够满足环保部门和排污企业的实际需要的在线监测模式检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法。

本发明的技术方案是：一种在线监测模式检测粪大肠菌群及大肠菌群的方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)显色底物的选择；

(2)标准曲线的测定或线性方程参数确定：取菌样梯度稀释接种入显色培养基，同时将同样的稀释菌样接种入底物平板或MPN管确定各种稀释度粪大肠菌群或大肠杆菌的数量；

(3)计算特征时间：设定特征，将显色底物显色达到该设定特征数值的时间作为特征时间；

(4)步骤(2)所得菌数目求对数与对应特征时间成线性，做出标准曲线或者求出线性方程lgx_o＝At_T±B中的参数A和B的数值；

(5)未知浓度样品接入显色培养基同上求取特征时间，根据特征时间在标准曲线上找到对应的浓度或者将特征时间代入参数完整的线性方程求得菌浓(x_o)的数值。

测量粪大肠菌群的显色底物为：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷或其他修饰的β-D-半乳糖苷或4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷或其他修饰的β-D-葡萄糖醛酸苷，培养温度为44--45℃。

测量大肠菌群的显色底物为：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷四种之一或混合物及4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)其他修饰的β-D-葡萄糖醛酸苷，培养温度为36.5-37.5℃，同时以4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)进行定量。

本发明的效果是：本方法可用于检测复杂样品中的粪大肠菌群及大肠杆菌，具有特异、高效、快速、准确、稳定的特点；并且本方法使用在线仪器，取样到结果可见时间差取决于样品为2-10小时之间，远远快于常规检测，有利于实际推广和应用，能够满足环保部门和排污企业的实际需要。也为政府部门监管和企业质控提供了快速可靠的检测方法。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

附图说明

图1为菌生长曲线图；

图2为图1的曲线微分图；

图3为一阶最值时间对接种浓度对数图；

图4为原理样机所作梯度稀释的的单克隆培养物在底物培养基中再培养过程特征波长吸光度实时监测图；

图5特征时间对接种浓度对数作曲线图。

具体实施方式

粪大肠菌群及大肠杆菌检测原理：

酶-底物法检测粪大肠菌群的依据是粪大肠菌群的定义。粪大肠菌群在44.5℃可以利用乳糖发酵产酸产气。则粪大肠菌群含有利用乳糖的一系列酶，这当中就包括β-D-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)。β-D-半乳糖苷酶可水解不同的底物生成有色物质，从而完成对大肠杆菌的快速检测。本系统采用的是含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)或对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)或邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)或间硝基苯基-β-D-半乳糖苷(MNPG)或其他修饰的β-D-半乳糖苷的培养基进行培养显色。