[发明专利]一种基于多聚A RNA在溶液中合成cDNA的方法

说明书

本申请是申请日为2004年10月29日，国际申请号PCT/US2004/036309，国家申请号为200480032335.6，发明名称为“用于高通量定量全血中mRNA的设备和方法”的申请的分案申请。

相关申请

本申请是2003年10月30日提交的美国专利申请No.10/698,967的部分 继续申请，该美国专利申请是2003年4月24日用英语提交并有望用英语公 布的国际专利申请PCTUS03/12895的部分继续申请，并且本申请还要求2002 年4月24日提交的临时申请No.60/375,472的优先权。

技术领域

本发明涉及高通量分离和定量全血中mRNA。更特别地，本发明涉及用 于分离和扩增mRNA的方法和设备，其使用附着到固定寡聚(dT)的多孔板 上的白细胞滤器的组合。

背景技术

分子生物学领域的研究显示可以从对其核糖核酸(RNA)的研究中推导 出细胞的遗传起源和功能活性。这种信息可以在临床实践中用于诊断感染、 检测细胞表达致癌基因的出现、检测家族性疾病、监测寄主防御机制的状态 以及确定HLA类型或者特性的其它标记。RNA以三种功能不同的形式存在： 核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。然而稳 定的rRNA和tRNA参与翻译的催化过程，mRNA分子携带遗传信息。总RNA 中由只有大约1～5％的mRNA、大约15％的tRNA以及大约80％的rRNA组 成。

mRNA是重要的诊断工具，特别是当其用于定量观测基因的上调或者下 调时。人的外周血是用于mRNA分析非常好的临床来源。例如，对血中特异 性嵌合mRNA的监测可以暗示不正常细胞的出现，并且应用于慢性骨髓细胞 性白血病(CML)的分子检测(Kawasaki E.S.，Clark S.S.，Coyne M.Y.，Smith S.D.，Champlin R.，Witte O.N.和McCormick F.P.1988年，Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro，Proc.Natl.Acad.Sci.美国85：5698～5702， Pachmann K.，Zhao S.，Schenk T.，Kantarjian H.，El-Naggar A.K.，Siciliano M.J.， Guo J.Q.，Arlinghaus R.B.和Andreeff M.2001年，Expression of bcr-able mRNA individual chronic myelogenous leukaemia cells as determined by in situ amplification，Br.J.Haematol.112：749-59)。通过监测癌特异性mRNA可以 检测微转移的癌细胞，例如对直肠癌监测癌胚抗原(CEA)、对前列腺癌监测 前列腺特异抗原(PSA)和对甲状腺癌监测甲状腺球蛋白(Wingo S.T.，Ringel M.D.，Anderson J.S.，Patel A.D.，Lukes Y.D.，Djuh Y.Y.，Solomon B.，Nicholson D.，Balducci-Silano P.L.，Levine M.A.，Francis G.L.和Tuttle R.M.1999年， Quantitative reverse transcription-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healthy subjects，Clin.Chem.45：785-89)以及对黑色素瘤 监测酪氨酸酶(Pelkey T.J.，Frierson H.F.Jr.和Bruns D.E.1996年，Molecular and immunological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumors，Clin.Chem.42：1369～81)。而且，由于这些癌特异性mRNA水平在 治疗后发生改变，特异mRNA的定量在后续治疗过程中提供了有用的指标。