[发明专利]一种HIV侵染细胞的筛选系统及其应用

权利要求书

1.一种HIV侵染细胞的筛选系统，包括趋化因子受体筛选细胞系和HIV 包膜蛋白Env筛选细胞系，所述筛选系统由如下方法构建：(1)将DnaE 内含肽基因的C端与报告基因的C端拼接，插入质粒1中获得融合表 达载体1；将DnaE内含肽基因的N端与报告基因的N端拼接，插入质 粒1中获得融合表达载体2；(2)将人CD4蛋白基因插入质粒2，获得 重组表达载体3；将人趋化因子CCR5基因或CXCR4基因插入质粒1， 获得重组表达载体4；(3)将HIV-1病毒株Env基因HXB2-env或 SF162-gp160基因插入质粒3，获得重组表达载体5；(4)将载体1或 载体2中的一个，与载体3和载体4共转染至HEK293细胞或CHO细 胞，获得稳定表达的趋化因子受体筛选细胞系；(5)将载体1或载体2 中的另一个，与载体5共转染至CHO细胞或HEK293细胞，获得稳定 表达的HIV包膜蛋白Env筛选细胞系；所述报告基因为用于检测的有 活性的酶基因或可发光的蛋白基因，所述的报告基因的C端与报告基 因的N端拼接即为报告基因，所述质粒1、质粒2、质粒3为在哺乳动 物细胞内高效表达蛋白的载体。

2.如权利要求1所述的筛选系统，其特征在于所述筛选系统由如下方法 构建：(1)将DnaE内含肽基因的C端与报告蛋白基因的C端拼接， 插入质粒pcDNA3.1中获得融合表达载体1；将DnaE内含肽基因的N 端与报告蛋白基因的N端拼接，插入质粒pcDNA3.1中获得融合表达 载体2；(2)将人CD4基因插入质粒pFLAG-CMV^TM-3，获得重组表达 载体3；将人趋化因子CCR5或CXCR4基因插入质粒pcDNA3.1，获 得重组表达载体4；(3)取HIV包膜蛋白基因HXB2-env插入质粒pSV7d 或SF162-gp160基因插入质粒pCAGGS，获得重组表达载体5；(4)将 载体1或载体2中的一个，与载体3和4共转染至HEK293细胞或CHO 细胞，获得稳定表达的趋化因子受体筛选细胞系；(5)将载体1或载 体2中的另一个，与载体5共转染至CHO细胞或HEK293细胞，获得 稳定表达的HIV包膜蛋白Env筛选细胞系。

3.如权利要求1或2所述的筛选系统，其特征在于步骤(2)重组表达载 体4中插入的目的基因为人趋化因子CCR5基因，步骤(3)重组表达 载体5中插入的目的基因为HIV-1病毒株SF162的包膜蛋白SF162 gp160。

4.如权利要求1或2所述的筛选系统，其特征在于步骤(2)重组表达载 体4中插入的目的基因为人趋化因子CXCR4基因，步骤(3)重组表 达载体5中插入的目的基因为HIV-1病毒株HXB2的包膜蛋白 HXB2-env。

5.如权利要求1或2所述的筛选系统，其特征在于所述报告基因为下列 之一：①缘色荧光蛋白基因、②红色荧光蛋白基因、③Renilla荧光素 酶基因、④Firefly荧光素酶基因、⑤碱性磷酸酶基因、⑥Bete-内酰胺 酶基因、⑦LacZ基因。

6.如权利要求1或2所述的筛选系统，其特征在于所述DnaE内含肽基因 来自蓝球藻(Anacystis nidulans)R2 PCC7942或点状念株藻(Nostoc punctiforme)PCC73102。

7.如权利要求1或2所述的筛选系统，其特征在于所述DnaE内含肽基因 的N端系从蓝球藻菌株(Anacystis nidulans)R2 PCC7942基因组DNA 中克隆DnaE内含肽基因的N端，记为dnae-N，所述DnaE内含肽基因 的C端系从蓝球藻菌株(Anacystis nidulans)R2 PCC7942基因组DNA 中克隆DnaE内含肽基因的C端，记为dnae-C。

8.如权利要求1所述的筛选系统在高通量筛选CCR5或CXCR4拮抗剂中 的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用为：将趋化因子受体 筛选细胞系细胞和HIV包膜蛋白Env筛选细胞系细胞加入添加有待筛 选药物的适用于CHO细胞或HEK293细胞的培养基中，混合培养4～8 小时，培养产物经洗涤、细胞裂解，加入与报告基因相对应的反应底 物，获得待测药物活性数据。