[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，尤其涉及一种β-葡萄糖苷酶的制备方法。

背景技术

大豆是畜禽的主要蛋白饲料，在饲料成分中占有很大比例，大豆中含有丰富的大豆异黄酮。最初人们对大豆异黄酮的研究是针对人体的，研究发现在人体大豆异黄酮对防治癌症、预防心血管疾病、防治女性老年骨质疏松等都具有明显的疗效。近年来大豆异黄酮的研究开始在动物上开展，大量的动物试验表明，大豆异黄酮具有促进动物生长、增强机体免疫力、提高动物泌乳性能、增加产蛋量、提高繁殖机能、促进动物体内养分再分配、提高蛋白质合成效率和改善畜禽胴体及瘦肉率等多种营养生理功能。但大豆异黄酮主要以糖苷形式存在，占总量的97％-98％，结合型大豆异黄酮不能渗入肠上皮细胞。必须经微生物水解为苷元，才能被吸收并进入外周循环，这样大部分大豆异黄酮资源并不能很好的被动物体利用，造成了资源的浪费。

研究发现，β-葡萄糖苷酶可将结合型的大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离型苷元，从而有效的提高大豆异黄酮的生物利用率。该酶最初是在苦杏仁中被发现，随后在酵母、细菌、真菌等微生物中也纯化出了β-葡萄糖苷酶。但不同来源的β-葡萄糖苷酶具有明显的种属特异性，不同的菌株不同的培养条件会影响β-葡萄糖苷酶的发酵水平，同时目前的对β-葡萄糖苷酶的生产多采用深层发酵法，固态发酵由于产β-葡萄糖苷酶产量低其应用一直受到限制，但固态发酵比深层发酵具有经济优势，它可以利用丰富、廉价的农副产品作为发酵底物，发酵粗产物可直接作为酶源。本发明从菌种的筛选出发到固体培养基和培养条件的优化，以使在固体培养条件下也能实现β-葡萄糖苷酶的高产，为β-葡萄糖苷酶的产业化发展提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，该方法成本低、产酶量高、可大规模推广利用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备培养基：包括：

(A)制备斜面种子培养基：将皮马铃薯、蔗糖和琼脂加入水中，经121℃灭菌20min，得到斜面种子培养基，其中，皮马铃薯含量为200g/l，蔗糖含量为20g/l，琼脂含量为20g/l；

(B)制备固体种子培养基：按照重量1∶1比例将麸皮加入水中，搅拌均匀，经121℃灭菌30min，得到固体种子培养基；

(C)制备固体生产培养基：按重量百分比90～100％∶0～10％∶1～3％的比例将麸皮、米糠和氯化氨混合，经121℃灭菌30min，得到固体生产培养基；

(2)制备斜面种子：将黑曲霉菌株划线接种在斜面种子培养基上，于28℃恒温培养5d后，得斜面种子；

(3)制备种子：将步骤(2)得到的斜面种子种在固体种子培养基中，于28℃下恒温培养72h，得到种子；

(4)发酵生产：将步骤(3)所获得的种子以10⁶～10⁸cfu/g固体培养基的接种量，接种到固体生产培养基上，在固体培养基中添加质量百分比为其0.5％的MgSO₄·7H₂O和质量百分比为其1.5％的KH₂PO₄，调节培养基的起始含水量65～75％，PH5.5～6.5，于25～30℃培养48～80h，得β-葡萄糖苷酶。

本发明的有益效果是：本发明筛选出β-葡萄糖苷酶的高产菌种，利用丰富、廉价的农副产品作为发酵底物，产品成本低，质量好，优化后得到的酶活性很高，作为饲料添加剂应用于豆粕型日粮中，可显著的提高其吸收利用率，从而提高动物饲养的经济效益。

具体实施方式

本发明的β-葡萄糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：

一、制备培养基：包括，

1、制备斜面种子培养基：将皮马铃薯、蔗糖和琼脂加入水中，经121℃灭菌20min，得到斜面种子培养基，其中，皮马铃薯含量为200g/l，蔗糖含量为20g/l，琼脂含量为20g/l；

2、制备固体种子培养基：按照重量1∶1比例将麸皮加入水中，搅拌均匀，经121℃灭菌30min，得到固体种子培养基；

3、制备固体生产培养基：按重量百分比90～100％∶0～10％∶1～3％的比例将麸皮、米糠和氯化氨混合，经121℃灭菌30min，得到固体生产培养基。

二、制备斜面种子：将黑曲霉菌株划线接种在步骤1的斜面种子培养基上，于28℃恒温培养5d后，得斜面种子，放置4℃冰箱内保存，备用；