[发明专利]抗PRRSV-N-IgY抗体的制备及在检测PRRSV中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(porcine productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)核衣壳蛋白(N)蛋白特异性卵黄免疫球蛋 白(抗PRRSV-N-IgY抗体)的制备，及其在以间接免疫荧光检测(IFA)方法检测PRRSV中 的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine productive and respiratory syndrome，PRRS)主要病原猪繁 殖与呼吸障碍综合征病毒(porcine productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)于1987 年首先发现于美国，在临床上主要表现流产、早产、死胎、木乃伊、仔猪成活率逐渐下降 和育成猪呼吸道症状等。给养猪业带来了灾难性的经济损失。1991年Wensvoort等利用猪 的肺泡巨噬细胞(PAM)首次分离出PRRS病原(Lelystad)，我国郭宝清等(1996)首次报道从流 产胎儿中分离到PRRSV，从而证实猪繁殖与呼吸综合征在我国的存在。我国在1995年少 数猪场暴发该病，数月之内迅速蔓延至全国，目前PRRS已成为我国规模化猪场引起母猪 繁殖障碍和猪呼吸道疾病的主要疫病之一。根据抗原性差异将各地PRRSV分离株分为欧 洲型(原型毒株为LV)和北美洲型(原型毒株为VR-2332)，这两种病毒有相似的生物学性质， 但是又有着明显的血清学差异性。

PRRSV属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，是单股正链有囊膜的RNA 病毒，其病毒粒子共有7种结构蛋白，复制酶和聚合酶活性蛋白、核衣壳蛋白(N)、基质蛋 白(M)、糖基化囊膜蛋白(GP5)和3个糖基化蛋白(GP2、GP3和GP4)。ORF1a和ORF1b位 于基因组5′末端，占病毒基因组近3/4部分，编码具有复制酶和聚合酶活性的蛋，ORF2-5 分别编码病毒的糖蛋白GP2-5，ORF6编码膜蛋白(M蛋白)，ORF7编码保守性的N蛋白。

ORF7通常由123(北美洲型)或者128(欧洲型)个氨基酸组成，是一种小的高度碱性的 蛋白质，分子量约为14-15kDa。N蛋白是病毒粒子中含量最多的蛋白质，免疫原性极强， 通常在感染PRRSV后，首先产生的是针对它的抗体，并且可持续半年以上。此外，在其 N末端有很多碱性氨基酸，这可能有利于与病毒基因组RNA的结合。N蛋白大部分以二 硫键连接的同型二聚体的形式存在，并聚合形成二十面体核心结构。N蛋白有5个抗原表 位，其中4个线性表位1个构象性表位，在其C末端的11个氨基酸在构象表位的形成中 起着关键作用。另外，虽然N蛋白保守性好，但这些表位都不能引起中和抗体的产生。可 是此蛋白具有良好的诊断学意义，现已建立了以重组N蛋白为基础的ELISA诊断方法， 特异性强，重复性好，成本低廉，应用前景十分广阔。另外，根据最新研究表明，N蛋白 对于病毒粒子的致病性和与宿主细胞受体的结合也有关系。

鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)作用等同于哺乳动物的IgG，但与其他哺乳动物制备多克隆抗 体相比，特异性IgY抗体制备有着经济、易操作、产量大等优点，目前纯化的IgY抗体已 广泛在免疫沉淀反应、免疫电泳、ELISA、免疫电镜、免疫吸附和Western-blot等诊断检 测技术和治疗上应用。本发明旨在建立抗PRRSV-N蛋白特异性IgY抗体的制备方法及基 于抗PRRSV-N-IgY抗体检测PRRSV的间接免疫荧光检测(IFA)方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种抗PRRSV的N蛋白特异性卵黄免疫球蛋白(抗 体)的制备方法，并进一步提供了基于抗PRRSV-N-IgY抗体的间接免疫荧光检测(IFA)方法。

为解决技术问题，本发明提供的解决技术方案为：

提供一种抗PRRSV-N-IgY抗体的制备方法，包括步骤：

(1)抗原制备