[发明专利]一种酸性蛋白酶的制备方法

权利要求书

1.一种酸性蛋白酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)诱变处理

单孢子悬液制备：在斜面培养基上加入无菌水，用接种环刮取培养物表面的孢子，制成粗制的孢子悬液。将此悬液振荡20min，过滤悬液，制成孢子浓度约10⁶个/ml的单孢子悬液，将孢子悬液涂布于平板培养。

将平板培养好的菌丝体用1％组合酶于室温下处理，过滤离心收集原生质体，并调节原生质体浓度，用紫外诱变处理。

(2)生产菌株的筛选

将经诱变后的菌株培养，挑取菌落颜色淡化、形态异常或孢子丰满的菌株，斜面保存。将菌落初筛获得的变异菌株接种于初始发酵培养基中，摇瓶培养，选取多产酸性蛋白酶的突变菌株，进行下一步摇瓶复筛。选出酸性蛋白酶产量最高的菌株。

(3)酸性蛋白酶的生成

将摇瓶筛得到的菌株先经过种子培养，然后转入固体发酵培养基恒温发酵培养。发酵完毕后抽提后用氯化钠和硫酸铵混合盐析，后经干燥得到酸性蛋白酶。

2.根据权利(1)中的所述斜面培养基为：NaNO₃ 0.2％，K₂HPO₄ 0.1％，KCl 0.05％，MgSO₄ 0.05％，FeSO₄ 0.001％，蔗糖3％，琼脂1.5％，pH 6.7；斜面平板培养时间为18h，诱变组合酶为：纤维素酶∶蜗牛酶∶溶菌酶＝0.7％∶0.2％∶0.1％，室温处理时间为2h；原生质浓度为106CFU/ml；紫外诱变处理时间为45s。

3.根据权利(2)中所述的初始发酵培养基为：麸皮13.0g，豆饼粉4.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏1.5g，NH₄NO₃ 0.5g，KH₂PO₄ 0.2g，FeSO₄ 0.2g，MgSO₄ 0.2g，H₂O9.0mL，pH5.5。

4.根据权利(3)中所述的种子培养基为：麸皮5.36％，KH₂PO₄ 0.15％，CaCl₂ 0.005％；固体发酵培养基为：麸皮17.79g，豆饼粉4.53g，KH₂PO₄ 0.205g，H₂O 9.0mL，pH5.5；恒温发酵温度为30℃，时间为48h；抽提温度为40℃，氯化钠为0.2mol/L，硫酸铵为0.02mol/L。