[发明专利]一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法

权利要求书

1.一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于该方法是以人的骨髓为原料，通过分离其间充质干细胞，在组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸处理后，依次加入成纤维细胞生长因子4、肝细胞生长因子、抑瘤素和地塞米松，诱导其向肝细胞分化；包括如下步骤：

(1)骨髓间充质干细胞的分离与制备；

(2)进行丙戊酸预处理后，不同细胞因子组合方式诱导培养细胞向成骨、脂肪和软骨方向的诱导分化；

(3)分化肝细胞的鉴定。

2.如权利要求1所述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤(1)中的分离与制备包括如下步骤：

a)从成年健康自愿者获取骨髓；

b)用密度梯度离心法分离其中的单个核细胞；

c)用差异生长贴壁法纯化单个核细胞中的骨髓间充质干细胞。

3.如权利要求2述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤a)中的原料取自成年健康自愿者的骨髓，并加入肝素抗凝剂，肝素抗凝剂剂量为10.0～12.5IU/ml血液。

4.如权利要求2述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤b)中单个核细胞通过下述方法获得：用磷酸盐缓冲的生理盐液将从步骤a)中获取的骨髓洗涤2次，并将骨髓稀释成细胞悬液，加至人淋巴细胞分离液上层，室温2200rpm/min离心25分钟后，取中间单个核细胞层，加入基础培养液洗涤细胞，然后1000rpm低速离心6～7分钟，弃上清，得到人的骨髓单个核细胞。

5.如权利要求2述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤c)是将经过步骤b)得到的骨髓单个核细胞用含10％FBS的基础培养液重新悬浮后，按4×10⁴/cm²密度接种于一次性塑料培养瓶，置37℃，5％CO₂培养箱中培养，48h后倒去培养液，用PBS冲洗两次，弃去未贴壁的细胞，加入新鲜基础培养液继续培养，当原代培养细胞覆盖培养瓶底面积约70％～90％时，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，通过有限稀释法接种在孔板中；每3天更换新鲜基础培养液，选取形态均一、生长良好的细胞，用胰酶消化收集细胞，继续进行传代培养，得到含有单一纯化的人骨髓间充质干细胞的基础培养液。

6.如权利要求1述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤(2)中的诱导培养细胞是将经过步骤(1)处理后得到的含有单一纯化的人骨髓间充质干细胞的基础培养液中加入诱导物；诱导物采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸以及含有细胞因子的培养液；首先加入丙戊酸预处理72小时后，去除含有丙戊酸的培养液，加入含有细胞因子的培养液，所述的细胞因子为成纤维细胞生长因子4、肝细胞生长因子、抑瘤素和地塞米松，其中含有细胞因子的培养液是指将细胞因子均先按照比例加入到基础培养基里得到；每三天换上述培养液，分别诱导培养至7天，14天和21天，得到基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化的肝细胞，然后进行肝细胞分化的鉴定。

7.如权利要求6述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于所述诱导物的加入量分别是：5mM丙戊酸；20ng/ml成纤维细胞生长因子4；30ng/ml肝细胞生长因子；20ng/ml抑瘤素和40μg/ml地塞米松。

8.如权利要求1述的一种基于VPA诱导的人骨髓间充质干细胞体外分化肝细胞的方法，其特征在于所述的步骤(3)中的肝细胞分化的鉴定包括：形态学观察、肝细胞特异性基因及蛋白表达分析、细胞糖原合成能力检测、尿素合成功能检测、白蛋白分泌功能检测、细胞色素P450活性检测、细胞诱导组蛋白H3和H4的免疫荧光检测和特异性蛋白印记检测。