[发明专利]一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，具体 地说，本发明涉及应用四重实时荧光定量PCR技术在一个PCR反应管中快速、 平行地同时检测四型人乳头瘤病毒(HPV-6，-11，-16，-18)的方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)是一种双链DNA病毒，通过人体接 触传播，在多种皮肤黏膜的良、恶性增生和生殖器感染中较为常见，迄今为止， 全世界已发现逾120多种HPV基因型，各型HPV与其生物学行为存在着高度 相关性，不同基因型的HPV具有不同的致病危险性，一般分为高危型HPV和低 危型HPV。

高危型HPV感染可以引起女性宫颈及其他生殖器癌变，而宫颈癌是最常见 的女性恶性肿瘤之一，全球每年约有50万新增病人，发病率在女性肿瘤中占第二 位，但其死亡率则占第一位，95％以上的宫颈癌与人乳头瘤病毒感染有关。低危 型HPV感染可导致宫颈上皮细胞轻度病变、产生生殖器疣、皮肤、经常性喉或 呼吸道乳头状瘤等。在引起人类生殖器、肛门等部位感染的诸多基因型HPV中， 最常见的只有四种基因型别HPV(HPV-6、-11、-16、-18)。一些研究表明，大约 70％的宫颈上皮细胞发育不良和宫颈癌是有HPV-16，-18感染引起的，其中 HPV-16约占55％，HPV-18约占10-15％，另外，相当一部分的阴道、外阴、肛 门、阴茎等部位癌变与HPV-16、-18持续感染密切相关。在男女外生殖器病变 中，90％以上的外生殖器疣是由HPV-6、，-11感染引起的，另外肛门疣也主要是 HPV-6，-11感染造成的。在中国，约有90％的生殖器疣肛门疣由HPV-6、-11型 引起，中国妇女宫颈癌组织中HPV感染率大于95％，其中HPV-16、-18型占 90％以上。

鉴于HPV-6、-11、-16、-18的高感染率及其危害性，预防HPV感染尤其是 HPV-6、-11、-16、-18感染可以有效控制宫颈癌和尖锐湿疣等的发生，因此， 全球很多公司都在研制HPV疫苗，Merck公司已经研制出了针对HPV-6、-11、 -16、-18型的四价疫苗，并在很多国家得以应用，然而，在应用四价疫苗前， 必须要了解被接种者是否感染了HPV，尤其是HPV-6、-11、-16、-18，只有在被 接种者未感染HPV-6、-11、-16、-18情况下，才可以接种HPV四价疫苗，所以 首先必须为接种者检测HPV-6、-11、16、-18，因此，同时快速准确的HPV-6、 -11、16、-18分型检测意义重大。

HPV感染的潜伏期长，不易在体外培养，亚临床感染常见，加之血清学试验又不 能区别近期和远期感染，因此，对HPV感染的分型诊断，目前主要依赖分子生物 学手段对病毒DNA进行检测。目前常用的方法有PCR、基因芯片技术、DNA 测序和第二代杂交捕获法，其中杂交信号放大法的杂交捕获II代(HC-II)和靶 DNA扩增法的PCR方法是目前应用最多的HPV-DNA检测方法。

但是，这些方法大多对操作人员要求高，试剂昂贵，同时所需临床标本量大，需 对临床标本多次扩增及多次分离分析，技术复杂，无法在临床检测中快速高通量 地检出患者感染的HPV病毒类型及病毒载量。目前第二代杂交捕获法(HC-II) 是惟一通过FDA批准的可在临床使用的一种检测HPV-DNA的技术，但仍然存在 不能分型和定量的缺点。

在PCR基础上发展起来的多重实时荧光PCR技术同时检测多种或型病毒也 有应用。但是，目前报道的荧光定量PCR检测HPV要么通量低，要么技术复杂、 试剂昂贵、要么未实现四型HPV单管同时定量检测，难以满足临床上同时检测 多个亚型的需要。但是，由于荧光定量PCR方法由于成本低、方便快速、操作 简单、可以定量等诸多优点，该方法值得优化提高从而能够在临床上广泛应用。