[发明专利]制备单核细胞型干细胞的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分离，培养，扩增的方法及应用，具体是指单核细胞型干细胞的制备方 法及在制备药物中的应用。

技术背景

多功能性的干细胞是人体的一种宝贵资源。干细胞被广泛用来进行研究，药物生产和药 物治疗，其中包括骨髓干细胞移植。干细胞可以用来研究信号系统调节分化过程，也可以用 来查明并测试药物的有效性和毒副作用，或用于更换由于疾病或环境的影响而损坏的组织。 然而，当前多能干细胞生物学和药用前景存在着很大的缺点和争议。

使用来自胎儿，脐带或体外受精胚胎组织的多能干细胞会引起伦理和法律问题，同时还 会带来感染的问题和免疫排斥的问题。特别是胚胎干细胞还有一些特定的缺点。举例来说， 胚胎干细胞要通过若干中间阶段才成为需要的细胞类型来治疗某种特定疾病。此外，胚胎干 细胞可能会被受捐助人的免疫系统所排斥，因为胚胎干细胞的捐助人和受捐助人往往不是同 一个人。

其中一个能规避这些问题的方法是利用自体干细胞，优选外周血。骨髓细胞中有部分细 胞能够逆向分化成血液细胞系以外的其他细胞。然而，最近的研究提出对这一结果提出质疑， 这样的逆向分化，可能是成熟细胞与干细胞融合产生的新的干细胞。重要的是，从骨髓中获 取干细胞往往是一个痛苦和繁琐的过程。

因此，需要发明出一个分离，培养，保持，扩增，分化为干细胞的方法(尤其是容易提 取的成人干细胞)，并培养成各种细胞类型以用于多种用途。这些用途可能包括但不限于使 用自体干细胞来治疗疾病和改善疾病带来的症状。

发明内容

本发明提供了一个由单核细胞制成干细胞的方法。本发明还包括制备，扩增和使用该种 单核细胞型干细胞和该种干细胞衍生物的方法。本发明中的单核细胞型干细胞来自于外周血， 外周血转化生成的干细胞具有很高的成本效益。这些单核细胞型干细胞可以很容易进行体外 扩增。本发明中的单核细胞型干细胞可以用来治疗疾病，改善与任何与此类疾病有关的症状。

本发明提供的分离单核细胞和转化方法包括分离外周血单核细胞和用细胞因子处理单核 细胞。这些细胞因子包括M-细胞集落刺激因子(M-CSF)，白介素-6(IL-6)和白血病 抑制因子(LIF)。在这些细胞因子培养下，单核细胞扩增分化成多功能性干细胞。处理前 的单核细胞可以是经过冷冻复苏的细胞，而处理后的单核细胞型干细胞也可以冷冻保存。

本发明中的单核细胞型干细胞具有明显的干细胞表现型，这些表现型至少包括一种下面 的细胞表面标志(MAC-1，CD14，CD34，CD40和CD45)，或至少能够生产一种细胞因子(IL-13， IL-6和IL-12p70)，或显示出吞噬活性，或显示淋巴细胞活化活性，或显示对胰蛋白酶， 乙二胺四乙酸的耐受性，或显示对利多卡因的敏感性。获取的单核细胞型干细胞的表现型中， 优选吞噬活性，其次是至少有一个以上细胞表面标志，其次是生产上面的任意一种细胞因子， 其次是显示淋巴细胞活化活性，其次是显示对胰蛋白酶，乙二胺四乙酸的耐受性，其次是显 示对利多卡因的敏感性。

本发明获取的单核细胞型干细胞至少表达下面各种细胞表面抗原的一种：MAC-1，CD14， CD34，CD40和CD45。本发明获取的多功能干细胞优选不表达CD la和CD83的细胞。

本发明提供的方法包括分离和获取单核细胞型干细胞，和对干细胞用诱导分化剂进行有 效的诱导分化。本发明优选使用用于扩增和维持的培养液进行诱导分化。本发明优选人的单 核细胞型干细胞，本发明也包括使用冷冻保存的单核细胞型干细胞和单核细胞型干细胞分化 的功能细胞。

本发明还提供了一种识别细胞类型的方法和根据上述方法鉴定出的分化的功能细胞。 本发明对细胞扩增，分化的描述是本行业中具备普通技能的人士所通常理解的含义。例如， 本发明对单核细胞型干细胞的维持，增长和分化为神经细胞所采用的神经细胞生长因子，维 持，增长和分化的条件有非常详细的描述。

本发明还对单核细胞型干细胞的维持，增长和分化为血管内皮细胞，上皮细胞，T，NK淋 巴细胞，巨噬细胞和肝细胞所采用的细胞生长因子，维持，增长和分化的条件有非常详细的 描述。本发明的单核细胞型干细胞包括但不仅仅局限于人，也包括其它哺乳动物的来源。