[发明专利]利用解链特征图谱检测多重荧光PCR产物的方法及产品

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种利用解链特征图谱检测多重荧光PCR产 物的方法及其产品，该方法可以在一个荧光定量PCR反应中同时检测多个荧光PCR扩 增的基因产物。更具体的说，该方法利用不同目的基因片段在解链过程中生成的不同的 解链特征图谱，运用荧光定量PCR方法，针对多个基因同时进行检测。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术发明至今已近20年了，在这 期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR) 技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准 确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 在实时荧光定量PCR技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：(1)在90 年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针， 因此使得间接的检测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的 反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化 发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。

目前实时荧光定量PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染 色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非 特异的检测两大类。

荧光定量PCR技术融合了PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程 中荧光信号的变化，使PCR的扩增及其分析在同一封闭的系统下完成，具有特异性好、 灵敏度高(是常规PCR的100倍以上)、假阳性低、操作简单、交叉污染机会少、不污 染环境(不需要使用EB)等优点，因此其应用范围很广泛，包括mRNA表达的研究、 DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性(SNPs)的测定等。目前研究的热点有：

1.1微小残留病变的检测    肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的 易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年 里治疗方案的改进已大大地延长了病人的生存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险 性。因此微小残留病变(MRD)的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。荧光定 量PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过对肿瘤融 合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。急性粒细胞性白血病(AML) 最常见的染色体异常是交互易位t(8；21)(q22；q22)，在这易位中，AML-1转录因子基因 和8号染色体的MTG8基因发生融合，致使正常的AML-1转录调控受到影响，这可能是 白血病的病因。目前的研究证明用荧光定量PCR来检测融合基因有助于对这些病人的 MRD进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价值的。同样的方法也被用 于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒细胞性白血病(CML)的BCR-ABL融合基 因；急性淋巴细胞性白血病(ALL)的白血病特异的TEL-AML1融合基因；滤泡状淋巴 瘤(FL)的染色体易位t(14；18)(q32；q21)和bcl-2重排等。许多研究都在很大程度上受益 于荧光定量PCR方法的应用，随着技术的发展，荧光定量PCR的运用将不断地扩大。

1.2细胞因子的表达分析    细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应(包括淋巴 细胞活化、增殖、分化、生存和凋亡)在免疫系统中起着核心作用。许多不同类型的细 胞都能分泌这种低分子量的蛋白质，其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内 皮细胞和成纤维细胞。细胞因子可被分为不同的组；白介素(IL-1～IL-23)，干扰素(IFN-α， IFN-γ等)，集落刺激因子(CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，肿瘤生长因子(TGF-β等) 和化学因子(MCP-1，MIP-1等)。为了阐明在许多炎症反应，自身免疫性疾病和器官 移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA表达谱的可靠定量是很重要的。尽管被检 样本中细胞因子含量往往极低，然而real-time反转灵PCR(RT-PCR)以其高敏感性和准 确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。