[发明专利]通过埃希氏菌属细菌生产L-氨基酸的方法

说明书

本申请为分案申请，原申请的申请号为02108086.0，申请日为2002年2月13日，发明名称为“通过埃希氏菌属细菌生产L-氨基酸的方法”。

技术领域

本发明涉及生物技术，具体地涉及通过发酵生产L-氨基酸的方法且更具体的涉及获自大肠杆菌的基因。这些基因对于提高L-氨基酸生产能力是有用的，例如：L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-精氨酸。

背景技术

传统的L-氨基酸工业生产方法是发酵方法，通过利用来源于自然环境中微生物菌株或特定修饰的突变株来提高L-氨基酸生产能力的。

已经公开了很多提高L-氨基酸生产能力的技术，例如：通过重组DNA转化微生物(参见例如US4,278,765)。这些技术的基础是提高在氨基酸生物合成中的酶活性和/或使被L-氨基酸产物反馈抑制的酶脱敏(参见例如，日本专利申请No56-18596(1981)，WO95/16042或美国专利No.5,661,012和6,040,160)。

在另一方面，提高的氨基酸分泌可以增强L-氨基酸生产菌株的生产能力，拥有增强表达L-赖氨酸分泌基因(lysE基因)的埃希氏菌属细菌菌株已被公开(WO 9723597A2)。另外，编码适合于L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或四氢噻唑衍生物的分泌蛋白的编码基因也已经公开(美国专利No.5,972,663)。

现在，一些编码能提高L-氨基酸生产的推定的膜蛋白的大肠杆菌基因被公开。rhtB基因的额外的拷贝使细菌具有优选的对L-高丝氨酸的抗性并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生产(欧洲专利申请EP994190A2)。此外，rhtC基因的额外的拷贝使细菌具有优选的对L-高丝氨酸和L-苏氨酸的抗性并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-亮氨酸的生产(欧洲专利申请EP1013765A1)。此外，yahN，yeaS，yfiK和yggA基因的额外的拷贝提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的生产(欧洲专利申请EP1016710A2)。尽管，大肠杆菌K-12菌株的全长基因细序列已经描述(Blattner F.R.，Plunkett G，Bloch C.A.et al.，Science，227，1453-1474，1997；ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz)，但其中的很多ORFs，它们的功能尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是提高L-氨基酸生产菌株的生产能力并提供一种生产L-氨基酸的方法，例如通过菌株生产L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸或L-甲硫氨酸或L-精氨酸。

此目的是通过识别编码蛋白质的基因而达到的，这些基因并不参预目标L-氨基酸的生物合成途径中但能提高其产量。一个例子是这种蛋白质是一种具有L-氨基酸分泌活性的膜蛋白。在大肠杆菌全长基因组序列分析的基础上，拥有4或更多个推定的跨膜片段(TMS)的蛋白质被选择。努力筛选的结果，本发明人从中识别了几个基因，它们是：b2682，b2683，b1242和b3434，并进行了全面的研究。基因b2682和b2683已被认为是被推定的CDS，它可以编码功能未知的蛋白质(分别为GENE BANK登记号AE000353U00096序列的核苷酸数92到829和819到1154)。基因b2683也认为是ygaH。基因b1242已被认为是推定的CDS，它可以编码功能未知的蛋白质(GENE BANK登记号AE000222U00096序列的核苷酸数8432到9079)。基因b1242也认为是ychE。基因b3434已被认为是推定的CDS，它可以编码功能未知的蛋白质(GENEBANK登记号AE000420U00096序列的核苷酸数1463到2056)。基因b3434也认为是yhgN。

本发明人还发现通过提高b2682，b2683，b1242或b3434基因编码的蛋白质的活性，菌株的L-氨基酸生产能力也被提高，因此，本发明已经完成。

本发明如下：

1)一种L-氨基酸生产细菌，该细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)，该细菌经过修饰以致于该细菌的L-氨基酸生产可以通过提高以下A)或B)，和C)或D)定义的蛋白质在细菌细胞中的活性来提高：

B)一种包含序列表中SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白质；