[发明专利]一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定磷含量的方法，具体涉及一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法。 

技术背景

多糖广泛参与细胞的各种生命活动且具有多种生物学功能，如增强免疫特性、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、延缓衰老等，因而受到人们的普遍重视，得到相应的研究和开发。但多糖的活性直接或间接地受其结构的制约，因此，采取一定的方法对多糖结构进行适当修饰是有必要的。 

磷是人体内含量较多的元素，不仅参与构成骨骼、牙齿以及神经组织等软组织，还参与体内的一些重要代谢过程。核酸、磷蛋白、磷脂酶以及细胞内第二信使环腺苷酸、环鸟苷酸等是含磷基的化合物。高能磷酸化合物的合成、分解是机体利用、储存能量的主要方式，体内所有能量的产生，储存都取决于适量的磷供给。磷缺乏会出现低磷血症，表现为贫血、肌无力、骨痛、骨软化、全身虚弱，以致神经、精神异常。 

磷酸化多糖是磷元素以磷酸根的形式取代多糖上的羟基。磷酸化多糖保持了多糖的基本构型，同时使一些本无活性的糖类化合物具有了活性，或显著提高某些多糖的生物活性。研究表明，磷酸化多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和免疫调节剂等生物活性，其活性普遍高于多糖，且更易于为机体吸收和利用。 

现有测定磷含量的方法有：中子活化分析法(INAA)、原子发射光谱法(AES)、原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)、紫外分光光度法和荧光分光光度法、电化学分析法等。中国专利CN 101251489A于2008年8月27日公开了“一种测定沉积物中总磷含量的快速预处理方法”，将土样消解后加入显色剂，在700nm处进行测定。中国专利CN 1991339A于2007年7月4日公开了“一种分析样品中总磷含量的方法”，将待测样品与一种分 解剂混合，再用一种酸性溶液完全溶解，还原成磷钼蓝，利用磷钼蓝在710nm处有最大光吸收值进行测定，测得的吸光度值范围为0.3～0.7。中国专利CN1296173A于2001年5月23日公开了“含磷抗静电剂中无机磷含量的测定方法”，将抗静电剂中的无机磷用饱和硝酸钠萃取，消解后用磷钼黄在420nm处进行比色测定。以上方法中，样品的处理方法只是适合于所针对的样品，适用范围小，未明确测定的检出限和线性范围，从而导致其应用范围窄。文献“香菇多糖磷酸化修饰工艺条件的研究”(《食品与发酵工业》，2007，33(12)，64～67)2007年在《食品与发酵工业》第12期报道了测定香菇多糖磷酸酯中磷含量的方法，样品处理采用灰化法，处理时间长，过程繁琐，灰化成分溶解性不好，整个过程以主观判断为主，易导致测定结果不准确。中国专利CN 1635366A于2005年7月6日公开了“一种利用低分辨率电感耦合等离子体质谱仪检测磷的方法”，此方法通过测定磷的氧化物浓度来间接测量磷的浓度，但测试成本太高而难以普及。对于测定磷酸化多糖中磷含量的方法，人们期望有一种准确度高、重复性好、成本低且易于推广的测定方法。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重复性好、准确度高的测定磷酸化多糖中磷含量的方法。 

为解决上述技术问题，本发明一种测定磷酸化多糖中磷含量的方法，包括如下步骤： 

(1)绘制标准曲线并建立回归方程：取一定质量的NaH₂PO₄定容于容量瓶中制备磷酸根(PO₄^3-)浓度为10ug/ml的母液，再依次稀释制备0.2、0.5、1、2、3、4、5、7、9、10ug/ml的磷酸根梯度标准溶液，分别取上述梯度标准溶液3～5ml，加入1.8～3ml pH值为7.0的Tris缓冲液，摇匀后加入1.2～2ml浓度为125mg/ml的抗坏血酸水溶液，静置1～2min之后依次加入1.8～3ml浓度为1mol/L的H₂SO₄和0.6～1ml浓度为30mg/ml的钼酸铵溶液，混合均匀后在30～45℃的恒温水浴锅中保温20～30min，以蒸馏水代替所述标准溶液作为空白对照按同样条件处理，然后分别在824nm处测定光吸收值(即OD值，optical density)，以磷酸根浓度为横坐标(X)，光吸收值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并建立回归方程；