[发明专利]一种卵巢胰岛素抵抗模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物模型的构建方法，尤其涉及一种卵巢胰岛素抵抗模型的构建方法，属于动物病理模型的构建领域。

背景技术

多囊卵巢综合征(PCOS)是生育年龄女性常见的不孕原因，以卵巢功能异常为主要表现，并且与胰岛素抵抗和代偿性高胰岛素血症有关。但当前研究仅限于胰岛素作用的经典靶组织-骨骼肌、脂肪和肝脏等。胰岛素的受体同时也存在于卵巢组织内，这表明卵巢是胰岛素作用的另一个重要的靶器官。很显然以卵巢组织外的胰岛素抵抗和外周的高胰岛素血症来解释卵巢本身的功能异常是不确切的。因此，构建一种卵巢胰岛素抵抗的模型来进行研究胰岛素抵抗对卵巢功能的影响是必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的卵巢胰岛素抵抗模型的构建方法；

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种卵巢胰岛素抵抗模型的构建方法，包括以下步骤：小鼠处死后取出卵巢采用体外培养基在CO₂培养箱中进行体外培养；其中，在进行体外培养时向体外培养基中加入地塞米松进行诱导；

其中，所述的体外培养基优选为F-12培养基，其组成成分包括：5％BSA、0.1％DMSO，10nmol/l胰岛素；所述的CO₂培养箱中CO₂的含量是5％(V/V)，空气相对湿度是95％；

为了达到更好的效果，在进行体外培养时向体外培养基中加入浓度为100-300nmol/L地塞米松体外诱导卵巢48h-72h；更优选的，在进行体外培养时向体外培养基中加入浓度为300nmol/L的地塞米松体外诱导卵巢48h；

本发明通过体外培养小鼠卵巢，地塞米松诱导建立卵巢胰岛素抵抗模型，通过检测培养液葡萄糖含量评估胰岛素抵抗模型卵巢功能的变化情况。实验结果显示地塞米松诱导卵巢胰岛素抵抗的效果存在时间剂量依赖性，经Dex处理后，卵巢对葡萄糖的摄取量下降，在胰岛素刺激下，Dex处理的卵巢对葡萄糖的摄取量更明显下降，卵巢胰岛素抵抗模型理想。

本发明采用不同的浓度地塞米松和不同的诱导时间来诱导小鼠卵巢，实验结果发现，应用300nmol/L地塞米松诱导48h，所构建的卵巢胰岛素抵抗模型最为理想。

本发明所涉及到的缩略术语：

Dex：地塞米松

RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应

BSA：牛血清白蛋白

DMSO：二甲基亚枫

PCOS：多囊卵巢综合征

附图说明

图1地塞米松的不同的诱导浓度和不同的诱导时间对卵巢胰岛素抵抗模型的影响；A：基础组卵巢葡萄糖摄取量；B：胰岛素刺激后卵巢葡萄糖摄取量；

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

实验动物由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，选取雌性昆明白小鼠(体重为(18±1)g/只)，经阴道涂片确定周期稳定并处于动情间期的小鼠为实验对象。小鼠处死后，取卵巢用于体外培养。小鼠卵巢取出后在显微镜下剥离周围组织，放入含有生理盐水的50mm的培养皿中，用配备好的DMEM和5％BSA的混合液冲洗卵巢三次以上。每组随机放入四个小鼠卵巢用F-12培养基进行体外培养，培养液成分：5％BSA、0.1％DMSO和10nmol/l的胰岛素，其中四组加入相应浓度的地塞米松，在空气湿度95％，CO₂含量5％的培养箱中培养。应用不同浓度(100nmol/L、300nmol/L)的地塞米松分别体外诱导小鼠卵巢48h和72h，确定地塞米松的最佳作用浓度及时间。具体分组为：未应用地塞米松培养卵巢48h组(A1)、100nmol/l地塞米松诱导48h组(A2)、300nmol/l地塞米松诱导48h组(A3)、未应用地塞米松培养卵巢72h组(B1)、100nmol/l地塞米松诱导72h组(B2)、300nmol/l地塞米松诱导72h组(B3)。

培养液葡萄糖含量的测定：培养液葡萄糖含量的测定分为基础组和胰岛素刺激组。基础组为应用DEX培养相应时间后，取六组培养液，测定葡萄糖含量。胰岛素刺激组是在应用DEX培养相应时间并更换培养液后，每组都加入200nmol/L的胰岛素刺激2h，再测定培养液含糖量。在基础组中(图1A)，两种浓度的地塞米松诱导的卵巢葡萄糖摄取量都低于未应用地塞米松的相同培养时间组，A3组培养液葡萄糖摄取量明显低于A1组(9.9±0.78vs.36.18±1.7，p＜0.05)。图1B所示为胰岛素刺激后各组卵巢葡萄糖摄取量的变化。培养48h组呈现对地塞米松剂量依赖性的下降，A3组葡萄糖摄取量明显低于A1组(7.74±0.3vs.38.34±1.2，p＜0.01)，延长培养时间至72h，葡萄糖摄取没有进一步的下降。这些结果说明应用300nmol/L地塞米松诱导48h，所构建的卵巢胰岛素抵抗模型最为理想。