[发明专利]一种靶向c-myc癌基因的外指引序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新的靶向外指引序列及其用途。

背景技术

外指引序列(External Guided Sequence，以下均简称EGS)技术于80年代后期首先发现，其主要功能是体内定向灭活功能基因，EGS为小分子RNA功能分子，因而应该属于广义的RNA干扰技术(RNAi)。但与目前流行的RNAi技术不同的是，EGS采用更短的RNA分子(10mer)，即可特异作用于靶基因，从而导致靶基因定向灭活。目前针对EGS的国际专利已存在，但美国专利说明书US6,057,153、US6,783,981和US5,877,162等主要是针对单个EGS分子的设计。目前仍没有实用的可用于高通量EGS的筛选的EGS文库(简称LEGS)，而这种文库的产生将有益于针对特殊疾病如爱滋病、肝炎及癌症等的基因新药的开发。

发明内容

本发明首先是通过EGS文库的构建，得到了EGS文库，然后通过此文库进行筛选，得到了一种新的靶向c-myc癌基因的外指引序列，通过一系列实验，证明此序列可以显著地抑制c-myc癌基因在蛋白质水平上的表达，从而可以用于制备预防和/或治疗c-myc癌基因高表达疾病药物。

附图说明

图1为EGS文库设计图，其中：

图1-1：“3/4 EGS”设计框架来源于大肠杆菌酪氨酸转运RNA的前体序列；

图1-2：外指引序列文库，外指引序列识别结构域由随机碱基组成；为了避免“CCA”序列直接暴露给核酸酶，“UUU”序列连接在它的3′末端；

图1-3：外指引序列文库与潜在的靶标RNA形成的复合体，箭头指示了核酸酶P的切割位点。

图2为引物FLEGSp和RLEGSp示意图；部分随机化的寡聚核苷酸FLEGSp和RLEGSp由两部分组成，一部分用于扩增pET28a-D载体(除了不包含T7启动子和T7终止子之间的片段以外，可等同于pET28a载体)，另一部分用于扩增外指引序列文库表达框；

图3为EGS文库构建示意图，其中：

图3-1：pET28a-LEGS构建的流程图；

图3-2：pET28a-LEGS的PCR产物鉴定图，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带；

图4为EGS文库鉴定示意图，其中：

图4-1：pET28a-EGS克隆酶切鉴定模式图，RV1泳道为含一个HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意图，RV2泳道为含二或三个HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切示意图，V泳道为pET28a被HincII酶切后的酶切示意图，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带；

图4-2：pET28a-EGS克隆酶切鉴定图，1到42号泳道均为含一个HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切图谱，V泳道为pET28a被HincII酶切后的酶切图谱，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带；

图4-3：pET28a-EGS克隆酶切鉴定图，1号泳道均为为含两个或三个HincII酶切位点的pET28a-EGS克隆被HincII酶切后的酶切图谱，V泳道为pET28a被HincII酶切后的酶切图谱，箭头指示了大小为5-kb的DNA条带；

图4-4：部分EGS表达框序列的多重比较结果。

图5为体外转录制备EGS示意图，其中

图5-1：EGS制备流程图；

图5-2：EGS的体外转录模板鉴定图；

图5-3：转录制备的EGS产物；

图6为EGS文库功能筛选意图，其中：

图6-1：体外筛选功能性EGS示意图；

图6-2：功能性EGS体内验证示意图；

图7为EGS-c-myc功能鉴定示意图，其中：

图7-1：为EGS-c-myc结构示意图；

图7-2：为EGS-D-c-myc结构示意图(EGS-c-myc的阴性对照)，园形标记标示了碱基突变；

图7-3：为c-myc mRNA被RNaseP体外切割所产生的产物的示意图，泳道M为RNA Marker，箭头指示了大小为2-kb的RNA条带，星号指示了大小为0.5-kb的RNA条带，泳道1为c-myc mRNA被RNaseP体外切割所产生的产物；

图7-4为c-myc表达水平检测结果，其中：

图7-4-1为荧光实时定量PCR检测结果，