[发明专利]一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I(DNA TopoisomeraseI)连接DNA片段的方法。

背景技术

传统基因克隆方法利用T4DNA连接酶(T4DNA Ligase)的方法将待克隆的目的基因与载体连接，将该重组子转化到受体菌中，筛选鉴定正确的克隆。但是该方法涉及的步骤多，并且繁琐费时。目前还有一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I的切割和连接功能，连接DNA片段的方法。牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别CCCTT，TCCTT，CCCUU，TCCUU，CCCTU，TCCTU位点。Invitrogen公司已利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别CCCTT位点的特性，经DNA拓扑异构酶I酶切，形成不同的粘性末端，成功应用于TA、平端克隆，以及定向克隆。该方法和传统方法相比，具有快速，效率高的特点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I(DNA Topoisomerase I)可以识别CCCTT，TCCTT，CCCUU，TCCUU，CCCTU，TCCTU位点并同时具有酶切和连接功能的特点，用以连接DNA片段，并应用于TA、UA、平端克隆及定向克隆载体构建的新方法。用此方法制成试剂盒，将大大方便使用者，为实现基因克隆、表达、蛋白功能等研究提供良好的技术平台。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，并用于TA、UA、平端克隆及定向克隆载体构建的新方法，具体：

一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，该方法通过引物设计，利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I的酶切和连接作用实现DNA片段的连接，其步骤包括：

(1)设计引物：对至少两个待连接的DNA片段分别设计引物，每条待连接片段设计正向引物和反向引物，相邻连接处对应的前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物的5’到3’端依次包含接头DNA序列、牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列以及与相应模板配对的DNA序列，其中所述前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物中的接头序列反向互补配对，不同连接处的互补接头序列不同；

(2)片段扩增

分别以相应待连接DNA片段为模板，以各自的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)片段连接

将待连接片段混合，加入牛痘病毒DNA拓扑异构酶I，37℃15min，得到重组DNA片段。

所述步骤(2)后，还包括对PCR扩增产物进行纯化的步骤。

所述步骤(1)中牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点为XCCYZ，其中，X为T或C；Y为T或U；Z为T或U。

所述步骤(1)中，在引物设计过程中，引物中包含的接头DNA序列为至少3个核苷酸。

本发明的优点：传统的DNA片段连接方法，需要利用限制性内切酶使DNA片段产生相匹配的末端，纯化后利用T4连接酶连接片段。与传统方法相比，本发明提供的DNA片段连接方法利用了牛痘病毒DNA拓扑异构酶I同时实现酶切与连接的功能，因此具有更加快速、高效的特点；待连接片段内部的序列不会对连接产生影响，消除了传统方法中酶切步骤的缺陷；互补的接头序列设计灵活多变，且连接特异性高，使得这种连接方法适用范围更广泛，特别是针对多个片段的连接构建有明显的优势。

附图说明

图1：使用本发明方法构建的重组DNA片段的示意图；

其中：A和B分别为两条待连接DNA片段

C为重组DNA片段

A’为A的扩增产物，B’为B的扩增产物

1为引物1(A的正向引物)，2为引物2(A的反向引物)

3为引物3(B的正向引物)，4为引物4(B的反向引物)

引物2和引物3从5’到3’端依次包含接头DNA序列、牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列以及与相应模板配对的DNA序列，两条引物中的接头DNA序列反向互补配对，其中：空心方框为牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列；实心方框为PCR扩增后的牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点；

图2：实施例1中两元件连接的电泳图；

其中：泳道M：1Kb Plus DNA Ladder，

泳道1、2：片段1、片段2

泳道3：两片段的连接产物。

具体实施方式