[发明专利]抗HCV药物筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于抗病毒药物筛选领域，具体地，涉及在2a型嵌合病毒J6/JFH1感染Huh 7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCV cellculture，HCVcc)基础上，以干扰素和利巴韦林为阳性对照，建立抗HCV药物的MTT细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价方法。

背景技术

Chiron在长期大量的研究后，1989年将输血后非A非B型肝炎定义为丙型肝炎(hepatitis C)，并分离和确认其病原体为丙型肝炎病毒(HCV)。丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科，肝炎病毒属，为有包膜的单股正链RNA病毒，全长约9.6kb。在过去的20年中，在世界范围内，约有1.7亿人感染HCV。感染HCV的约80％的病例特点是持久性和慢性肝病疾病，20％慢性丙型肝炎患者最终发展成为肝硬化和肝癌。在工业化国家，丙型肝炎病毒相关的终末期肝病现在主要采取肝移植方法。在临床治疗中，干扰素(interferon，IFN)起到了重要的作用，1990年开始用单剂IFN进行慢性丙型肝炎治疗，在10％的病人中产生持续病毒学应答(sustained virologicresponse，SVR)。而经过近年用聚乙二醇(PEG)改良的聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)与利巴韦林(ribavirin)联合治疗，病毒学持续应答提高到50％，但是治疗效果仍不理想，利巴韦林在红血球中积累，会伴有溶血性贫血等不良反应，并且1型HCV感染患者SVR率仍然偏低。因此，发展新的高效的治疗具有重大意义。

在干扰素治疗发展的同时，最引人注目的研究是在基础研究上建立的支持自主HCV RNA复制的细胞培养系统的发展。1999年，Lohman等人首次报道建立了能在Huh 7中自主复制的亚基因组HCV RNA复制子系统，这个复制子系统的不仅应用于针对结构蛋白作为药物靶点的的筛选，同样还用于研究HCV RNA的复制机理。在此基础上，一些学者使用不同的HCV病毒株(H，N，Con1和O)建立了全基因组长度的HCV RNA复制系统。这些复制子系统促进了HCV的研究及抗HCV药物的筛选，但是其不能产生完全的病毒颗粒，所以存在缺陷。在泡疹性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus，VSV)、HIV或鼠白血病病毒(mouse leukemia virus，MLV)的基础上与HCV E1和E2蛋白嵌合得到的病毒假病毒系统(HCV pseudotypeparticles，HCVpp)，广泛应用于筛选以包膜蛋白为靶点的抗HCV化合物和免疫研究。但是由于HCVpp本身的结构和来源，HCVpp只能用于HCV感染性的研究而无法研究HCV的复制。

复制子系统发展成为一个研究HCV复制和抗病毒药物筛选的重要工具，但是在药物筛选过程有局限性，所以2005年细胞培养系统的出现，无疑是一项突破性的进展。这是从一名爆发性丙型肝炎患者体内分离得到的2a型病毒株JFH1株，不需要适应性突变就能进行自主复制，并感染Huh 7人肝癌细胞后，其RNA能在细胞中复制，重组病毒颗粒能分泌至培养液中，且分泌的病毒颗粒对Huh 7细胞和黑猩猩具有感染性。其后Brett等人利用J6病毒株的结构蛋白区与JFH1株的非结构蛋白区嵌合产生的病毒J6/JFH1感染由Huh 7.5衍生而来的对HCV更易感的Huh 7.5.1的体系，对抗HCV药物进行了药效评价。HCV细胞培养体系的建立是近年来HCV研究中的重大突破，是今后了解HCV完整增殖周期、研究抗HCV治疗方法和开发丙型肝炎疫苗的强有力技术平台。

迄今，现有技术中未见有在2a型嵌合病毒J6/JFH1感染Huh 7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCV cell culture，HCVcc)基础上，以干扰素和利巴韦林为阳性对照，建立抗HCV药物的MTT细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价方法。

发明内容

本发明目的是提供在2a型嵌合病毒J6/JFH1感染Huh 7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系(HCV cell culture，HCVcc)基础上，以干扰素和利巴韦林为阳性对照，建立抗HCV药物的MTT细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价方法。利用HCV细胞培养系统对抗HCV药物进行TMTT法细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

抗HCV药物筛选方法，包括下述步骤：

(1)细胞生长曲线制作，确定最适Huh 7.5.1细胞浓度；

(2)确定最适感染复数MOI；