[发明专利]蛋白酶检测系统

权利要求书

1.嵌合蛋白质，其包含至少一种有靶向到亚细胞器的运输信号的信号蛋白质和至少一种蛋白酶的蛋白酶剪切位点，将其构建为：

(a)通过连接蛋白水解位点或通过蛋白水解位点连接信号掩蔽蛋白质至信号蛋白质的N或C末端，失活所有信号蛋白质的运输信号，因此嵌合蛋白质存在于胞质溶胶中；

(b)当蛋白酶剪切位点被蛋白酶切割时，至少一种信号蛋白质的运输信号被活化，并导致至少一种包含活化信号蛋白质的片段蛋白质被转运到亚细胞器；和

(c)用至少一种荧光蛋白质标记嵌合蛋白质，荧光标记信号在细胞中的位置和强度分布根据蛋白酶的切割而改变。

2.嵌合蛋白质，其包含至少两种有靶向到亚细胞器的运输信号的信号蛋白质和至少一种蛋白酶的蛋白酶剪切位点，将其构建为：

(a)一种信号蛋白质的运输信号保持活性，通过连接蛋白水解位点或通过蛋白水解位点连接信号掩蔽蛋白质至信号蛋白质的N或C末端，失活其余信号蛋白质的运输信号，因此嵌合蛋白质被转运到特定的通过活性信号蛋白质运输信号靶向的亚细胞器；

(b)在嵌合蛋白质转运到亚细胞器后，至少一种蛋白水解位点和至少一种失活信号蛋白质暴露于胞质溶胶中；

(c)当蛋白酶剪切位点被蛋白酶切割时，所述的至少一种暴露于胞质溶胶的失活信号蛋白质的运输信号被活化，并导致包含活化信号蛋白质的片段蛋白质被转运到与嵌合蛋白质被转运的亚细胞器不同的亚细胞器；和

(d)用至少一种荧光蛋白质标记嵌合蛋白质，荧光信号在细胞中的位置和强度分布根据蛋白酶的切割而改变。

3.根据权利要求1和2任一权利要求的嵌合蛋白质，其中在蛋白酶剪切产生的片段蛋白质中，至少两种有不同的细胞定位特点的片段蛋白质，其各自包括一种荧光蛋白质，使用的荧光蛋白质由至少两种不同波长的荧光蛋白质组成。

4.根据权利要求1和2任一权利要求的嵌合蛋白质，其中在包含失活运输信号被蛋白酶剪切活化的信号蛋白质的片段蛋白质中，至少一种片段蛋白质包含荧光蛋白质。

5.嵌合蛋白质，其包含有靶向到亚细胞器的运输信号的信号蛋白质和通过蛋白酶的蛋白酶剪切位点与信号蛋白质连接的荧光蛋白质，将其构建为：

(a)由于嵌合蛋白质中信号蛋白质的运输信号保持活性，因此嵌合蛋白质被转运到亚细胞器；

(b)在嵌合蛋白质转运到亚细胞器后，蛋白酶剪切位点和荧光蛋白质暴露于胞质溶胶中；和

(c)因此，当暴露于胞质溶胶的蛋白酶剪切位点被蛋白酶切割时，暴露于胞质溶胶的荧光蛋白质被释放到胞质溶胶中。

6.权利要求5的嵌合蛋白质，其中保持活性的信号蛋白质用与暴露到胞质溶胶的荧光蛋白质荧光波长不同的荧光蛋白质进一步标记，且该另外的荧光蛋白质在蛋白酶剪切发生后仍附着在活性信号蛋白质上。

7.根据权利要求1和2任一权利要求的嵌合蛋白质，其中失活信号蛋白质的运输信号是靶向到选自线粒体、叶绿体和过氧化物酶体亚细胞器的信号。

8.根据权利要求1和2任一权利要求的嵌合蛋白质，其中失活信号蛋白质是选自拟南芥属外包膜蛋白质7(AtOEP7)、Rubisco小亚单位(RbcS)、叶绿素a/b结合蛋白质(Cab)、Rubisco活化酶(RA)、F1-ATPase和过氧化物酶体靶向基序(SKL)的全长蛋白质或其包含运输信号的片段。

9.根据权利要求2和5任一权利要求的嵌合蛋白质，其中保持活性的信号蛋白质的运输信号是靶向到选自线粒体、叶绿体和细胞核的外膜、过氧化物酶体膜和质膜之一的信号。

10.根据权利要求2和5任一权利要求的嵌合蛋白质，其中保持活性的信号蛋白质是与特定磷脂特异结合的蛋白质。

11.根据权利要求2和5任一权利要求的嵌合蛋白质，其中保持活性的信号蛋白质是选自拟南芥属外包膜蛋白质7(AtOEP7)、H+-ATPase、Pleckstrin同源结构域(PH)和FAPP(家族A(磷酸肌醇结合特异)成员3)的Pleckstrin同源结构域的全长蛋白质或其包含运输信号的片段。

12.根据权利要求1和2任一权利要求的嵌合蛋白质，其中信号掩蔽蛋白质选自氨基酸、肽和蛋白质。