[发明专利]干细胞冻存液及干细胞的冻存方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞冻存液以及干细胞的冻存方法。

背景技术

冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。温度的变化主要取决于降温或升温方法所引起的热传导的边界条件，也受细胞复融过程中潜热效应的影响。为了将冻融过程中细胞的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程。但需要在降温前加入一种或两种低温保护剂，在溶解后又将其去除。

为使细胞复苏时存活率最高，最佳的冷冻条件是尽可能地降低细胞内的晶体形成，减少细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。上述要求可通过下列方法获得：(1)缓慢冷冻，使细胞内水分离开细胞，但不可太慢，以避免冰晶形成；(2)用亲水的低温保护剂排除水分；(3)在尽可能低的温度下保护细胞，降低高浓度盐对冰中蛋白质变性的影响；(4)快速复苏，减少细胞内晶体形成，以及细胞内残余的冰溶解时可溶性成分的产生。

冻存影响因素：细胞浓度：以较高浓度冻存细胞，细胞的复苏活率更高。冷冻速率：大多数培养的细胞以1℃/min的速度冷冻存活率最高，这可能是快速冷冻减少冰晶形成和慢速冷冻增加细胞外水分迁移之间的一个折中。

冻存液：细胞悬液通常在加入细胞保护剂甘油或二甲基亚砜(DMSO)后进行冷冻，后者效果更好，原因可能与其穿透细胞的能力较甘油强有关。使用浓度为5％-15％。常用到的细胞保护剂还有，羟乙基淀粉(HES)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)等。

日本学者Makino S等报道，采用6％羟乙基淀粉联合5％DMSO冻存自体外周血干细胞(PBSCs)，比单纯的10％DMSO冻存方法效果更好，该方法将细胞冻存于-80℃，可获得较高的复苏活率(88.4+/-3.6％)，且复苏后细胞保持造血活性；长达1-5年的冻存也可取得较满意的效果；10位血液肿瘤患者输注复苏的自体PBSCs后，均显示细胞被成功植入，其中7位患者获得症状完全缓解的时间长达3.5-15个月。该方法在日本被广泛采用。

西班牙学者Servei D′Hematologia等报道，采用10％DMSO和自体血浆冻存自体PBSCs和骨髓细胞，复苏活率可达到90％，11位血液肿瘤患者输注复苏的自体PBSCs后，均显示细胞植入，其中10位患者获得症状完全缓解的时间长达3-9个月。

挪威学者研究则发现，相对于10％DMSO，5％DMSO冻存的PBSCs凋亡和死亡率都较低；103位血液肿瘤患者输注10％DMSO和5％DMSO冻存的自体PBSCs，其临床效果并无明显差别。该学者认为，从安全性方面考虑，应选择5％DMSO。荷兰学者的研究亦表明，5％DMSO冻存的复苏活率高于10％DMSO。

综上所述，造血干细胞库倾向于采用5％DMSO，若能配以自体血浆，则冻存效果更佳。同时，我们应该注意到，输注DMSO冻存的PBSCs可能与一些毒性反应有关，比如呕吐、心脏功能失调、过敏和急性肾衰，所以在保证冻存效果的前提下，应尽量降低DMSO的浓度。

发明内容

为有助理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明领域的普通技术人员通常理解的含义。

除非另外说明，本文中HES的百分含量表示重量百分含量，其他百分含量均表示体积百分含量。

除非另外说明，本文中的“基础培养基”指的是含有细胞生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，可供大多数细胞生长。

除非另外说明，本发明中的DMSO为二甲基亚砜的英文简称，HES为羟乙基淀粉的英文简称，AB表示人AB血清，FBS为胎牛血清的英文简称，MM为基础培养基的英文简称，HAS为人血清白蛋白的英文简称，MSC为脐带间质干细胞的英文简称。

本发明的一个目的是提供一种干细胞冻存液，该冻存液可以使冻存的干细胞有很好的冻存复活率，同时避免含有动物血清和培养基，使该冻存液在临床上更具有实用价值。

本发明的另一个目的是提供了一种干细胞冻存复苏的方法，该方法采用本发明所述的干细胞冻存液。

本发明一方面提供了一种干细胞冻存液，其中所述的冻存液含有二甲基亚砜和羟乙基淀粉。

优选地，所述的冻存液中含有5-10％体积的二甲基亚砜和3-6％重量的羟乙基淀粉。

更优选地，所述的冻存液含有5％体积的二甲基亚砜和6％重量的羟乙基淀粉。

优选地，所述的冻存液还含有人AB血清。

更优选地，所述的人AB血清的含量为10-80％体积。

再优选地，所述的人AB血清的含量为10-50％体积。