[发明专利]17-去甲基雷帕霉素及其类似物、它们的制备方法和用途

权利要求书

1.用于制备包括编码工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇的重组菌株的方法，其中，模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代。

2.根据权利要求1的方法，其中所述模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域被来自下列簇中的一种的丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代：雷帕霉素，莫能菌素，FK506，红霉素，FK520，两性霉素，安哥拉霉素，泰乐菌素，′hyg′，FK523，meridamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。

3.根据权利要求2的方法，其中所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列簇中的一种：雷帕霉素，莫能菌素和FK506。

4.根据权利要求3的方法，其中所述AT结构域选自下组：来自雷帕霉素模块2的AT结构域，来自莫能菌素模块3的AT结构域，来自莫能菌素模块6的AT结构域，来自莫能菌素模块8的AT结构域，来自FK506模块3的AT结构域和来自FK506模块7的AT结构域。

5.根据权利要求4的方法，其中所述丙二酰-CoA特异性AT结构域来自雷帕霉素的模块2。

6.根据权利要求1-5中任意一项的方法，其中所述方法包括以下附加步骤：

(a)分离作为具有合适的侧翼限制位点的单一DNA片段要导入的AT，

(b)利用合适的限制位点扩增并且分离与目标AT的侧翼序列同源的DNA序列的区域，

(c)将步骤(a)和(b)所述三种DNA片段连接在一起，以得到LHS同源性，随后是供体AT结构域，随后是RHS同源性的框内序列，

(d)将来自步骤(c)的完整序列导入用于导入宿主菌株的载体，以得到最终质粒，所述质粒包括：

i)用于接合的oriT，

ii)一种或多种抗性标记，

iii)温度敏感型复制起点，从而可通过在37℃培养来选择整合体，

和

iv)大肠杆菌复制起点，

(e)使用上面(d)中所述的最终质粒通过接合来转化所述宿主菌株，

(f)通过对相关抗生素的抗性选择转化体，

(g)通过在37℃培养，用抗生素选择来产生初级整合体，

(h)同样在37℃，通过在不进行抗生素选择的条件下的生长来筛选次级重组体，

(i)通过产生目标产物的能力鉴定需要的菌株，和

(j)通过标准方法任选地验证所述菌株的遗传学。