[发明专利]绒山羊PDK1基因cDNA编码区核苷酸序列

说明书

技术领域  本发明涉及从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码PDK1蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码PDK1蛋白质的cDNA编码区698bp的核苷酸序列和与它的第2位～第697位核苷酸序列对应的氨基酸序列。

背景技术  细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，它不仅受到时间和空间的限制，还受到营养条件和细胞内外环境条件的影响。在营养条件合适并有其它刺激生长的因子存在时，细胞通过生物大分子合成而使得质量和形态都得到增长，此时则表现为生长。

3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1/PDPK1)，是一个63KDa的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。作为细胞中很多重要信号通路的中心枢纽，广泛存在于人的很多组织中。起初，PDK1作为Akt1(PKB)的上游活化激酶而被发现。1997年，Alessi等从兔子的骨骼肌中分离纯化了一种蛋白激酶，可以磷酸化PKB的Thr308位点，PKB的活性增加30倍以上。然后他们在一些磷酸肌醇(PIs)存在的条件下检测该激酶的活性，发现这种活化以一种依赖PIP3或PIP2的方式完成，PDK1也就因此而得名。PKB的充分激活依赖磷酸化Thr308和Ser473氨基酸残基。一般认为PDK1只可将Thr308位点磷酸化，而活化另一位点Ser473的上游激酶目前尚无定论。

PDK1在激活AGC激酶家族成员中起着重要作用，除PKB外，PDK1还可能活化PKC的很多亚型，S6K(p70 ribosomal S6 kinases)，RSK(p90 ribosomal S6 kinases)，SGKs(serum-and glucocorticoid-inducedkinases)和PKA(protein kinaseA)等。被PDK1激活的AGC激酶成员具有共同的结构特征，即均含有两个保守的区域，激酶活性区内的T-loop区(activation-loop)和羧基端的疏水性的H-motif区域(hydrophobicmotif)。前者保守序列为T(F/L)CGT。后者保守序列为FXXF(S/T)(Y/F)，其中X为任意氨基酸。只有这两个保守区域同时磷酸化，激酶活性才被充分激活。PDK1中类似AGC家族的磷酸化位点Ser241可通过分子间二聚后的交叉自磷酸化促使PDK1活化，这也许可以解释为什幺哺乳动物细胞中PDK1多为组成性活化。另外，Src作为PDK1的上游激酶可磷酸化Tyr373/376和Tyr9两个位点。而Tyr9的磷酸化不仅与Src有关，还会受到ROS(reactive oxygen species)的影响。

PDK1活化AGC家族成员的机制不尽相同，可大致分为四组。第一组为脂依赖的底物，包括PKB和某些PKC亚型。PKB与细胞膜上的PIP3结合从而实现从胞浆移位至胞膜，并同时完成其构型的转变，以便处于近膜区的PDK1磷酸化其T-loop上的Thr308位点；在T-loop活化完成的同时，由PDK2(ritor-mTOR)完成对PKB HM的磷酸化，并在其催化结构域(catalytic domain)内通过α螺旋形成HM结合位点；最后，已发生磷酸化的HM结合到此位点，促使PKB活化完全。而某些PKC亚型则是通过与佛波醇、甘油二酯、磷脂酰丝氨酸、卵磷脂或PIP3相互作用，转化为PDK1的底物，从而完成T-loop活化，并且正是这种活化导致了PKC自身HM发生自磷酸化。第二组为磷酸化依赖的底物，包括S6K和SGK。与第一组不同，这种底物的HM先发生磷酸化，然后促使PDK1通过其PIF(PDK1-interacting fragment)结合区与该底物发生相互作用，进而磷酸化底物的T-loop；第三组为Rho依赖的底物，包括PRK1(PKC-related kinase)和PRK2。这种底物先通过N端结合Rho的结构域与Rho-GTP发生相互作用，然后导致构型改变，促使PDK1磷酸化其T-loop残基。第四组为T-loop残基组成性活化的底物，包括PKA和RSK。

迄今，关于PDK1在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究已在小鼠、大鼠、牛、人和猪等哺乳动物的细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见绒山羊细胞中PDK1的研究报道，也未见有绒山羊PDK1基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。