[发明专利]改良的DNA银氨染色法以及检测DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体而言，本发明涉及在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其在检测灵敏性和操作方便程度上带来了综合性能的改善。另外，本发明还涉及检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

发明背景

当前，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离DNA并使DNA条带显色(可视化)，已经成为生物检测中最常用的方法之一了。其中，使在聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条可视化可以采用荧光染料、可视有机染料和银等。可视有机染料，如亚甲蓝[1]、亮甲酚蓝[2]、结晶紫[3]、和尼罗河蓝[4，5]等，其灵敏性低而且操作耗时。荧光染料，如溴化乙锭(EB)、SYBR gréen、和SYBR gold，其能够插入DNA链中，因而检测效果不错，但是其需要配备专门的荧光检测仪器，而且会对实验操作人员产生致突变效果，因而极大地限制了它们的使用[6-8]。而银染技术已经在广泛应用于对聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离的蛋白质的检测[16]，也有报道银染[9-11]能用于核酸[17]和脂多糖[18]的染色。

银染技术技术根据用含银离子的溶液浸渗中所用的试剂而分成两大类。一类被称为银氨染色法，其使用银-氨溶液来浸渗凝胶，并用含甲醛的酸性溶液来显色，但是其灵敏性低而且操作过程费时[12]；另一类用酸性银离子溶液染色，其中凝胶浸渗在pH为弱酸性的硝酸银中，然后在碱性条件下用甲醛还原，然而其在进行DNA检测时，要么染色灵敏度高但操作过程比较复杂[19]，要么操作过程较简单但灵敏度不高[20-22]。

为此，本发明人经过长期实践研究，令人惊讶地在银氨染色法的基础上发明了一种改良的DNA染色法，其省略了固定和敏化的步骤从而降低操作繁琐程度并减少操作耗时，而且能提高检测灵敏性，仅仅在约40分钟的操作时间内就能检测到皮克(picogram)级的DNA条带(可达1.5pg)。另外，本发明人还发明了基于改良的DNA染色法的检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

发明内容

本发明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其在检测灵敏性和操作方便程度上带来了综合性能的改善。另外，本发明的目的还在于提供检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

具体而言，在第一方面，本发明的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其为银氨染色法，其特征在于，所述方法不包括固定和敏化的步骤。本发明第一方面的方法通常在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA后使用，对聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条带进行染色，尽管不优选，但是该方法也可以在用其他方式使DNA包裹在聚丙烯酰胺凝胶中之后使用。在本文中，银氨染色法本身为现有技术[12]，其依次包括洗涤步骤、敏化步骤、洗涤步骤、浸渗步骤、洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤。其中，浸渗步骤是用含银离子和氨的碱性溶液浸泡聚丙烯酰胺凝胶。由于本发明相对于现有技术(包括酸性银离子溶液染色法等，其中有固定步骤)，省略了固定和敏化的步骤，因而大大缩短了操作时间，简化了操作步骤，也避免使用了在固定和敏化步骤中所需的戊二醛、苯磺酸等对操作人员有害的试剂。优选在本发明的第一方面，所述方法依次包括第一次洗涤步骤、浸渗步骤、第二次洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤。这样，该方法在达到上述优点后还保留了现有银氨染色法的检测灵敏度。

在本文中，“依次”指的是所针对的步骤按其所出现的顺序执行，不能与其他步骤交换执行的顺序。优选在本发明的第一方面，所述方法依次由第一次洗涤步骤、浸渗步骤、第二次洗涤步骤、显色步骤和终止显色反应步骤组成。

在本文中，“第一次”与“第二次”用于区别洗涤步骤在操作流程上的次序，并不构成对洗涤步骤本身执行过程的限制。在本文中，“洗涤”指的是用溶剂清洗聚丙烯酰胺凝胶，用以洗去上一步骤残留在聚丙烯酰胺凝胶上的试剂。其中，优选溶剂是水、生理盐水或缓冲液，如Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液等，最优选是去离子水。优选在本发明的第一方面，所述方法中第一次洗涤步骤是用水洗涤聚丙烯酰胺凝胶。本发明人研究发现，第一次洗涤对于最终染色效果有显著的提升，是必须的，但是洗涤时间可以不必过长。因此优选其中，洗涤时间大于等于3分钟，更优选为5-30分钟，最优选为10分钟。另外也优选其中，洗涤次数为一次。其中这样最优选的方式大大节约了操作时间。